S.S.S.

Ofislerimizin bulunduğu illerde aynı gün, tüm Tükiye için ortalama 3 gün içinde adresinize ulaştırılmaktadır.

Evet.

WESTERN BLOT NUMUNE ALIM PROSEDÜRÜ

Hücre Kültürü Numuneleri İçin:

Adherent Hücreler İçin (Petri Kabı)

* Hücreler %80 yoğunluğa ulaşınca toplanmalıdır.

** Çalışma buz üzerinde gerçekleştirilmelidir.

*** Çalışmaya başlamadan önce santrifüj 4 °C’ye soğutulmalıdır.

• Hücrelerin ekili olduğu petri kabı buz üzerine yerleştirilir.
• Hücrelerin üzerindeki besiyeri dikkatlice aspire edilir.
• Hücreler, besiyeri kalıntılarını uzaklaştırmak için soğuk 10 ml PBS kullanarak yıkanır ve ardından PBS aspire edilir.

*PBS eklenirken dikkatli olunmalıdır. PBS yavaşça, hücreleri kaldırmamaya dikkat ederek eklenmeli ve dikkatlice karıştırılmalıdır. (Besiyeri hacmine eşit hacimde soğuk PBS kullanılabilir)

• Yıkama işlemi 2 kere tekrar edilir.
• Yıkama işlemi sonrası hücrelerin üzerine soğuk lizis tamponu eklenir ve buz üzerinde 5 – 10 dk inkübe edilir.

*Lizis tamponu miktarı ve inkübasyon süresi kullanılan tampona veya kite bağlı olarak değişmektedir.

**Lizis tamponu içerisine kullanmandan hemen önce Protease inhibitörü eklenmelidir, bu sayede protein bozunması engellenmektedir.

• İnkübasyon ardından soğuk hücre kazıyıcı kullanarak hücreler kazınır ve hücreler toplanarak mikrosantrifüj tüpü içerisine koyulur.
• Tüpler 14.000 G, 4 °C’de 15 dk santrifüj edilir.

*Kullanılan tampona veya kite göre santrifüj değerleri değişim gösterebilmektedir.

• Santrifüj sonrası süpernatant yeni ve temiz bir tüpe aktarılır ve buza gömülür.

* Süpernatantı alırken 200 µl’lik pipet ucu kullanılması tavsiye edilir.

      9- Örnekler daha sonra kullanmak için -80°C’de saklanmalıdır.

*Örneklerin alikotlayarak saklanması tavsiye edilir.

Adherent Hücreler İçin (Flask)

• Hücrelerin üzerinde bulunan besiyeri aspire edilir.
• Hücrelerin üzerine 10ml PBS eklenerek hücreler yıkanır, yıkama işlemi ardından PBS aspire edilir.
• Yıkanan hücrelerin üzerine Tripsin solüsyonundan 3mL eklenir ve inkübatörde birkaç dakika (3-5 dk) bekletilir (tripsin aktivitesinin artması için flaskın inkübatöre yerleştirilmesi tavsiye edilir).
• İnkübasyon işlemi sonrası tripsin inhibisyonu için hücrelerin üzerine 6mL fullbesiyeri eklenir ve hücreler aşağıda toplanacak şekilde pipetaj yapılır.

* Hücreler ortamdan kolay kalkmadığı durumlarda elle flaska vurularak kaldırılabilir.

• Sonra bu karışım falkona aktarılıp 1800 rpm 4 °C’de 5dk santrifüj edilir.
• Santrifüj sonunda alttaki pellet bozulmayacak şekilde süpernatantın hepsi atılır.
• Hücre pelletini uygun bir lysis buffer (örneğin, RIPA buffer, NP-40) ile karıştırılır ve buz üzerinde 5-10 dk inkübe edilir. (İnkübasyon süresi kullanılan buffer ve kite bağlı olarak değişebilmektedir)

*Lizis tamponu içerisine kullanmandan hemen önce Protease inhibitörü eklenmelidir, bu sayede protein bozunması engellenmektedir.

• İnkübasyon sonrası, karışımı 12,000G’de 10-15 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı alın (Süpernatant, toplam proteinleri içerir).
• Santrifüj sonrası süpernatant yeni ve temiz bir tüpe aktarılır ve buza gömülür.
• Örnekler daha sonra kullanmak için -80°C’de saklanmalıdır.
• Örneklerin alikotlayarak saklanması tavsiye edilir.

Numunelerin Transferi:

Numuneleriniz uygun koşullarda şirketimiz tarafından transfer edilecektir. Şirketimiz numunelerin transferini 78.5°C sağlayan kurubuz ile yapmaktadır.

Süspanse Hücreler İçin:

* Hücreler %80 yoğunluğa ulaşınca toplanmalıdır.

** Çalışma buz üzerinde gerçekleştirilmelidir.

*** Çalışmaya başlamadan önce santrifüj 4 °C’ye soğutulmalıdır.

• Hücrelerin ekili olduğu flask / petri kabı buz üzerine yerleştirilir.
• Flask / petri kabı içerisinde ekili olan hücre süspansiyonu bol pipetaj yapılarak toplanır ve falkon tüpe aktarılır.

*Bu aşamada flask yüzeyinde bulunan tüm hücreler toplanmaya çalışılmalıdır.

• Falkon santrifüje yerleştirilir ve 4 °C 2500G’de 5-10 dk santrifüj edilir.
• Santrifüj işlemi sonrası hücreler tüpün dibinde toplanacaktır (pellet) üstteki sıvı pellete dokunmamaya çalışarak dikkatlice atılır.

*Hücre pasajlama protokolünde uygulanılan süre ve RPM’de santrifüj işlemini gerçekleştirilebilir.

• Test tüpü buz üzerine yerleştirilir, pellet soğuk PBS ile yeniden süspanse edilerek bir kez yıkanır.
• Süspanse hücreler 4 °C 2.500G’de 5-10 dk santrifuj edilir ve üstte bulunan sıvıyı atılır.
• Test tüpü buz üzerine yerleştirilir, pellet üzerine lizis tamponu eklenir ve yukarı aşağı pipetaj yaparak hücreleri tekrar süspanse hale getirilir.
• Hücre süspansiyonunu buz üzerinde 5-10 dk bekletilir, hücrelerin parçalanması için ara ara çalkalanır.

*İnkübasyon süresi kullanılan lizis tamponuna bağlı olarak değişebilmektedir.

• İnkübasyon süresi ardından hücre süspansiyonunu 4°C’de 14.000 G’de 15 dk santrifüjleyin.
• Üstteki sıvıyı yeni ve temiz bir tüpe aktarın ve buza gömün.
• Örnekler daha sonra kullanmak için -80°C’de saklanmalıdır.

*Örneklerin alikotlayarak saklanması tavsiye edilir.

Numunelerin Transferi:

Numuneleriniz uygun koşullarda şirketimiz tarafından transfer edilecektir. Şirketimiz numunelerin transferini 78.5°C sağlayan kurubuz ile yapmaktadır.

Doku Numuneleri İçin:

Çalışmaları buz üzerinde gerçekleştirin, mümkün olduğu kadar çabuk bir şekilde dokudan parçalara ayırın.

• İlgi duyduğunuz dokuyu temiz aletler ile ayırın. (Bu aşama buz üzerinde gerçekleştirilmeli ve proteaz bozulmasını önlemek için mümkün olduğunca çabuk yapılmalı.)
• Ardından dokuyu soğuk 1X PBS ile kısa bir süre yıkayın. (Bu aşama dokuda bulunan kanı uzaklaştırmak için gerekmektedir ancak oldukça dikkatli olunmalı)

*Karaciğer, dalak gibi kan miktarı yüksek dokularda nazikçe yıkama yapılarak doku kandan temizlenmelidir.

*Beyin ve Testis dokusu gibi az kan bulunan dokularda yıkama işlemi yapılmaması tavsiye edilir.

• Doku alındıktan hemen sonra, dokuyu buz üzerinde tutarken daha küçük parçalara kesin, Eppendorf tüplerine koyun ve sıvı nitrojene daldırıp anında dondurun.

*Eppendorf tüpler etiketlenmelidir.

**Çalışma için 0.1 g doku yeterli olmaktadır.

• Örnekler daha sonra kullanmak için -80°C’de saklanmalıdır.

Numunelerin Transferi:

Numuneleriniz uygun koşullarda şirketimiz tarafından transfer edilecektir. Şirketimiz numunelerin transferini 78.5°C sağlayan kurubuz ile yapmaktadır.