Realtime PCR Analizi Nasıl Yapılır (Protokol)

REAL TIME PCR PROTOCOL

RNA Isolation

Doku numunelerinden total RNA eldesi Trizol Reagent (Invitrogen, 15596026) kullanılarak gerçekleştirildi.

1. 100 mg doku tartıldı, üzerine 1 ml TRIzol eklendi ve homojenize edildi.
2. 7000 RPM, 4°C’de 5 dk santrifuj edilidi.
3. Süpernatant oda ısısında 5 dk inkübe edildi.
4. 0.2 ml Kloroform eklendi, vortexlendi ve 2‑3 dk inkübe edildi.
5. İnkübasyon ardından 12.000 g, 4°C’de 15 dk santrifüj edildi.
6. Üst sıvı faz yeni bir tüpe aktarıldı ve üzerine 0.5 ml izopropanol eklendi.
7. 4°C’de 10 dk inkübe edildi.
8. 12,000 × g, 4°C’de 10 dk santrifüj edildi.
9. Süpernatant uzaklaştırıldı, pellet 1 ml %75 ethanol ile yıkandı, vortexlendi.
10. 7500 × g, 4°C’de 5 dk santrifüj edildi.
11. Süpernatant uzaklaştırıldı ve RNA kuruması için 5‑10 dk buz üzerinde bırakıldı.
12. RNA pelleti 25 µL nuclease free su ile çözdürüldü.
13. Qubit 4 Flourometer kullanılarak RNA konsantrasyonu ölçüldü.

cDNA Synthesis

FirstStrand cDNA Synthesis Kit (PROCOMCURE Biotech GmbH, PCCSKU1301) kullanılarak 0.2 ug RNA’dan cDNA sentezlendi.

Tablo1

1. Reaksiyon bileşenlerinin buz üzerinde çözünmesi beklendi.
2. Ardından tablo1’de belirtilen miktarlarda bileşenler bir araya getirilerek reaksiyon kuruldu.
3. 42°C’de 60 dk

80°C’de 10 dk

Real time PCR

2X Magic SYBR Mix (PROCOMCURE Biotech GmbH, PCCSKU1107) kullanılarak Real Time PCR yapıldı.

Tablo2

1. Reaksiyon bileşenlerinin buz üzerinde çözünmesi beklendi.
2. Ardından tablo1’de belirtilen miktarlarda bileşenler bir araya getirilerek reaksiyon kuruldu.
3. 95°C 5 dk 1 Cycle

95°C 10 saniye 40 Cycle

60°C 15 saniye 40 Cycle

72°C 20 saniye 40 Cycle

72°C 2 dk 1 Cycle