Sıkça Sorulan Sorular

Numune alım prosedürümüz (kolorimetrik ve elisa testleri için)

Numune Alım Prosedürü Kan Alınmadan Önce:

Ortalama 10 ile 12 saatlik açlıktan sonra kanın alınması gereklidir. (Tok kan alınması test sonuçlarını etkileyebilir ve lipemi’ye neden olabilir.)
Kan verecek kişinin en az 2 gün öncesine kadar alkol almaması gereklidir.

Kan alım süreçleri:

Kan profesyonel kişilerce uygun ekipman ve yöntemle alınmalıdır.
Kan kırmızı kapaklı boş veya sarı kapaklı jelli biyokimya tüpüne alınmalıdır. (Eser element testlerinde uygun tüp kullanılmalıdır.)
Kan alınmış tüp ortalama 30 ile 40 dakika boyunca dik bir şekilde bekletilmelidir. (bekleme süresi 60 dakikayı geçmemelidir.)(bekleme sürelerine uyulması eritrositlerin parçalanıp numuneyi hemoliz etmemesi için önemlidir)
Bekleme süresi sonunda kan alınmış tüp 3000rpm ile 10 dakika boyunca santrifüj edilmelidir.
Santrifüj sonrası kırımızı kan hücreleri özkütleden dolayı dibe çöker üstte “serum” oluşur.
İstenilen serum miktarını belirleyebilmek için toplam alınan kanın ortalama %60’ı kadar serum elde edilir.
Elde edilen serum eppendorf tüplerine pipet yardımıyla alınır.
Çalışma hızı ve karışıklığı önlemek açısından eppendorf tüplerinin üst kapağına ve yan tarafındaki tırtırlı alana sayı yazılır. Çalışılacak numune sayısı kadar numralandırma yapılır. Ör: 1,2,3……249,250

Numunelerin Saklanması:

Eppendorf tüplerine alınmış ve kapağı kapatılmış serumlar ‑80°C de 12 ay boyunca saklanabilir (bu süre geneldir farklılık içeren testler olabilir)
Serum elde edildiğinde 48 saat boyunca +4C de saklanabilir. (testlere göre süre değişkenlik gösterebilir.)

Numunelerin Transferi:

Numuneler A noktasından B noktasına ‑78.5°C sağlayan kurubuz ile yapılmalıdır. (şirketimiz transferi bu şekilde yapmaktadır) Veya dondurulmamış numuneler +4C transfer yapılacaktır.

Tüpler:

Kırımızı kapaklı veya sarı kapaklı(jelli) biyokimya tüpü kullanılmalıdır.

Numuneler hakkında dikkat edilmesi gerekenler:

Numune tüpleri numaralandırılırken etiket üzerine yapılmamalıdır taşıma sırasında etiketler kendini bırakmaktadır.
Numuneler sıralı bir şekilde numune kaplarına konulup kapağı açılmayacak derecede sıkıca kapatılmalıdır.
6 ve 9 numarasının altına karışıklığı önlemek adına alt çizgi çekilmelidir.
Numunelerle birlikte numune listesi de yollanmalıdır.
Doku örnekleri eppendorf tüpünde veya hava almayacak şekilde sarılmalı ve ‑80°C de saklanmalıdır. (dokular formaldehit içinde kesinlikle saklanmamalıdır.)

Hemolize sebep olan durumlar:

Yoğun turnike uygulanması
Tamamlanmamış santrifüj
Serum ayrılması için tam kan olarak 2 saattenuzun süre bekletme
Hematomlu bölgeden kan alınması
Enjektör kullanılması durumlarında; hızlı çekiş, karıştırma ve enjektörden tüpe hızlı bir şekilde boşaltma (çok gerekli olmadıkça enjektör kullanımından kaçınılmalıdır.
Soğutma ve/veya ısıtma

Doku numuneleri: Doku alındıktan sonra herhangi bir solüsyon içine alınmamalı, alınan doku alüminyum folyaya sarılıp eppendorf tüpüne alındıktan sonra ‑80°C de saklanmalıdır.

HbA1c Testi: tam kanda çalışılmaktadır. Kan edtalı tüpe (mor kapak) alınmalı ve +4 °C de muhafaza edilmelidir. Numune dondurulmamalıdır.

Süt numuneleri: Numuneler alındıktan sonra ‑80°C derede muhafaza edilmelidir. En az 5ml ortalama 10ml numune filtrasyon açısından önemlidir.

Kan Sayım (Hemogram): tam kanda çalışılmaktadır. Kan edtalı tüpe (mor kapak) alınmalı ve +4 °C de muhafaza edilmelidir. Numune dondurulmamalıdır. Numuneler ivedilikle gönderilmelidir.

Önerilen kan alma tüp markaları: BD ve Greiner

Detay

Western Blot Numune Alım Prosedürü

Hücre Kültürü Numuneleri İçin:

Adherent Hücreler İçin (Petri Kabı)

* Hücreler %80 yoğunluğa ulaşınca toplanmalıdır.

** Çalışma buz üzerinde gerçekleştirilmelidir.

*** Çalışmaya başlamadan önce santrifüj 4 °C’ye soğutulmalıdır.

Hücrelerin ekili olduğu petri kabı buz üzerine yerleştirilir.
Hücrelerin üzerindeki besiyeri dikkatlice aspire edilir.
Hücreler, besiyeri kalıntılarını uzaklaştırmak için soğuk 10 ml PBS kullanarak yıkanır ve ardından PBS aspire edilir.

*PBS eklenirken dikkatli olunmalıdır. PBS yavaşça, hücreleri kaldırmamaya dikkat ederek eklenmeli ve dikkatlice karıştırılmalıdır. (Besiyeri hacmine eşit hacimde soğuk PBS kullanılabilir)

Yıkama işlemi 2 kere tekrar edilir.
Yıkama işlemi sonrası hücrelerin üzerine soğuk lizis tamponu eklenir ve buz üzerinde 5 ‑ 10 dk inkübe edilir.

*Lizis tamponu miktarı ve inkübasyon süresi kullanılan tampona veya kite bağlı olarak değişmektedir.

**Lizis tamponu içerisine kullanmandan hemen önce Protease inhibitörü eklenmelidir, bu sayede protein bozunması engellenmektedir.

İnkübasyon ardından soğuk hücre kazıyıcı kullanarak hücreler kazınır ve hücreler toplanarak mikrosantrifüj tüpü içerisine koyulur.
Tüpler 14.000 G, 4 °C’de 15 dk santrifüj edilir.

*Kullanılan tampona veya kite göre santrifüj değerleri değişim gösterebilmektedir.

Santrifüj sonrası süpernatant yeni ve temiz bir tüpe aktarılır ve buza gömülür.

* Süpernatantı alırken 200 µl’lik pipet ucu kullanılması tavsiye edilir.

9‑ Örnekler daha sonra kullanmak için ‑80°C'de saklanmalıdır.

*Örneklerin alikotlayarak saklanması tavsiye edilir.

Adherent Hücreler İçin (Flask)

Hücrelerin üzerinde bulunan besiyeri aspire edilir.
Hücrelerin üzerine 10ml PBS eklenerek hücreler yıkanır, yıkama işlemi ardından PBS aspire edilir.
Yıkanan hücrelerin üzerine Tripsin solüsyonundan 3mL eklenir ve inkübatörde birkaç dakika (3‑5 dk) bekletilir (tripsin aktivitesinin artması için flaskın inkübatöre yerleştirilmesi tavsiye edilir).
İnkübasyon işlemi sonrası tripsin inhibisyonu için hücrelerin üzerine 6mL fullbesiyeri (%10 FBS, %1 Penisilin streptomisin,%1 L‑Glutamin içeren highglucose DMEM) eklenir ve hücreler aşağıda toplanacak şekilde pipetaj yapılır.

* Hücreler ortamdan kolay kalkmadığı durumlarda elle flaska vurularak kaldırılabilir.

Sonra bu karışım falkona aktarılıp 1800 rpm 4 °C’de 5dk santrifüj edilir.
Santrifüj sonunda alttaki pellet bozulmayacak şekilde süpernatantın hepsi atılır.
Hücre pelletini uygun bir lysis buffer (örneğin, RIPA buffer, NP‑40) ile karıştırılır ve buz üzerinde 5‑10 dk inkübe edilir. (İnkübasyon süresi kullanılan buffer ve kite bağlı olarak değişebilmektedir)

*Lizis tamponu içerisine kullanmandan hemen önce Protease inhibitörü eklenmelidir, bu sayede protein bozunması engellenmektedir.

İnkübasyon sonrası, karışımı 12,000G’de 10‑15 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı alın (Süpernatant, toplam proteinleri içerir).
Santrifüj sonrası süpernatant yeni ve temiz bir tüpe aktarılır ve buza gömülür.
Örnekler daha sonra kullanmak için ‑80°C'de saklanmalıdır.
Örneklerin alikotlayarak saklanması tavsiye edilir.

Numunelerin Transferi:

Numuneleriniz uygun koşullarda şirketimiz tarafından transfer edilecektir. Şirketimiz numunelerin transferini 78.5°C sağlayan kurubuz ile yapmaktadır.

Süspanse Hücreler İçin:

* Hücreler %80 yoğunluğa ulaşınca toplanmalıdır.

** Çalışma buz üzerinde gerçekleştirilmelidir.

*** Çalışmaya başlamadan önce santrifüj 4 °C’ye soğutulmalıdır.

Hücrelerin ekili olduğu flask / petri kabı buz üzerine yerleştirilir.
Flask / petri kabı içerisinde ekili olan hücre süspansiyonu bol pipetaj yapılarak toplanır ve falkon tüpe aktarılır.

*Bu aşamada flask yüzeyinde bulunan tüm hücreler toplanmaya çalışılmalıdır.

Falkon santrifüje yerleştirilir ve 4 °C 2500G’de 5‑10 dk santrifüj edilir.
Santrifüj işlemi sonrası hücreler tüpün dibinde toplanacaktır (pellet) üstteki sıvı pellete dokunmamaya çalışarak dikkatlice atılır.

*Hücre pasajlama protokolünde uygulanılan süre ve RPM’de santrifüj işlemini gerçekleştirilebilir.

Test tüpü buz üzerine yerleştirilir, pellet soğuk PBS ile yeniden süspanse edilerek bir kez yıkanır.
Süspanse hücreler 4 °C 2.500G’de 5‑10 dk santrifuj edilir ve üstte bulunan sıvıyı atılır.
Test tüpü buz üzerine yerleştirilir, pellet üzerine lizis tamponu eklenir ve yukarı aşağı pipetaj yaparak hücreleri tekrar süspanse hale getirilir.
Hücre süspansiyonunu buz üzerinde 5‑10 dk bekletilir, hücrelerin parçalanması için ara ara çalkalanır.

*İnkübasyon süresi kullanılan lizis tamponuna bağlı olarak değişebilmektedir.

İnkübasyon süresi ardından hücre süspansiyonunu 4°C'de 14.000 G'de 15 dk santrifüjleyin.
Üstteki sıvıyı yeni ve temiz bir tüpe aktarın ve buza gömün.
Örnekler daha sonra kullanmak için ‑80°C'de saklanmalıdır.

*Örneklerin alikotlayarak saklanması tavsiye edilir.

Numunelerin Transferi:

Numuneleriniz uygun koşullarda şirketimiz tarafından transfer edilecektir. Şirketimiz numunelerin transferini 78.5°C sağlayan kurubuz ile yapmaktadır.

Doku Numuneleri İçin:

Çalışmaları buz üzerinde gerçekleştirin, mümkün olduğu kadar çabuk bir şekilde dokudan parçalara ayırın.

İlgi duyduğunuz dokuyu temiz aletler ile ayırın. (Bu aşama buz üzerinde gerçekleştirilmeli ve proteaz bozulmasını önlemek için mümkün olduğunca çabuk yapılmalı.)
Ardından dokuyu soğuk 1X PBS ile kısa bir süre yıkayın. (Bu aşama dokuda bulunan kanı uzaklaştırmak için gerekmektedir ancak oldukça dikkatli olunmalı)

*Karaciğer, dalak gibi kan miktarı yüksek dokularda nazikçe yıkama yapılarak doku kandan temizlenmelidir.

*Beyin ve Testis dokusu gibi az kan bulunan dokularda yıkama işlemi yapılmaması tavsiye edilir.

Doku alındıktan hemen sonra, dokuyu buz üzerinde tutarken daha küçük parçalara kesin, Eppendorf tüplerine koyun ve sıvı nitrojene daldırıp anında dondurun.

*Eppendorf tüpler etiketlenmelidir.

**Çalışma için 0.1 g doku yeterli olmaktadır.

Örnekler daha sonra kullanmak için ‑80°C'de saklanmalıdır.

Numunelerin Transferi:

Numuneleriniz uygun koşullarda şirketimiz tarafından transfer edilecektir. Şirketimiz numunelerin transferini 78.5°C sağlayan kurubuz ile yapmaktadır.

Detay

PCR Numune Alım Prosedürü

Doku Numune Alım Prosedürü

Kullanılacak tüm aletlerin (bistüri, pens, vb.) steril olmalıdır. Mümkünse tek kullanımlık aletler tercih edilmelidir.

Çalışma alanı ve yüzeyi çalışmaya başlamadan önce uygun sterilizasyon yöntemleri ile temizlenmeli, sterilize edilmelidir.

Çalışma sırasında eldiven kullanmak, önlük giymek gibi steril tekniklere dikkat etmek gerekmektedir aksi takdirde DNA‑RNA kontaminasyonu kaynaklı yanlış pozitif sonuçlar alınmaktadır.

Doku örneklerini işlerken, çalışmayı mümkünse buz üzerinde yapmanız önerilir. Bu, doku örneklerinin bozulmasını ve proteinlerin degradasyonunu önlemeye yardımcı olur. Yıkama ve diğer işlemleri hızlı bir şekilde gerçekleştirmek, doku örneklerinin kalitesini korumak açısından kritik öneme sahiptir.

Hedef doku temiz, mümkünse tek kullanımlık aletler ile ayırılır.
Doku örneği soğuk 1X PBS ile kısa bir süre yıkanır.

Bu aşama dokuda bulunan kanı uzaklaştırmak için gerekmektedir ancak oldukça dikkatli ve hızlı olunmalıdır.

Doku alındıktan hemen sonra, doku örneği buz üzerinde daha küçük parçalara kesilir, önceden etiketlenmiş, temiz eppendorf tüplere koyulur ve sıvı nitrojene daldırıp anında dondurun.

Eğer sıvı nitrojen erişiminiz yoksa, ‑80°C’de saklamak da yeterli bir alternatiftir.

*Çalışma için 0.1 g doku yeterli olmaktadır.

Örnekler daha sonra kullanmak için ‑80°C'de saklanmalıdır.

Numunelerin Transferi:

Numuneleriniz uygun koşullarda şirketimiz tarafından transfer edilecektir. Şirketimiz numunelerin transferini 78.5°C sağlayan kurubuz ile yapmaktadır.

Tamkan Numune Alım Prosedürü

Tamkan numuneleri edtalı tüpe alınmalı ve kesinlikle dondurulmamalıdır. Numuneler +4°C de muhafaza edilmelidir. RNA ve DNA çalışmasına göre bekleme süreleri değişmektedir dolayısıyla numune almadan öncesinde bizimle iletişim kurunuz.

Hücre Kültürü Numune Alım Prosedürü

Adherent Hücreler İçin

Hücreler %80 yoğunluğa ulaşınca toplanmalıdır.

Çalışma alanı, yüzeyi ve kullanılacak aletler çalışmaya başlamadan önce uygun sterilizasyon yöntemleri ile temizlenmeli ve steril hale getirilmelidir (alkol ile silme).

Çalışma sırasında eldiven kullanmak, önlük giymek gibi steril tekniklere dikkat etmek gerekmektedir aksi takdirde DNA‑RNA kontaminasyonu kaynaklı yanlış pozitif sonuçlar alınmaktadır.

Çalışmayı mümkünse buz üzerinde yapmanız önerilmektedir.

Çalışmaya başlamadan önce santrifüj 4 °C’ye soğutulmalıdır.

Hücrelerin ekili olduğu petri kabı / flask buz üzerine yerleştirilir.
Hücrelerin üzerindeki besiyeri dikkatlice aspire edilir.
Hücreler, besiyeri kalıntılarını uzaklaştırmak için soğuk 1X PBS ile yıkanır ve ardından PBS aspire edilir.

*PBS eklenirken dikkatli olunmalıdır. PBS yavaşça, hücreleri kaldırmamaya dikkat ederek eklenmeli ve dikkatlice karıştırılmalıdır. (Besiyeri hacmine eşit hacimde soğuk PBS kullanılabilir)

Yıkama işlemi 2 kere tekrar edilir.
Yıkama işlemi sonrası hücrelerin üzerine hücreleri toplamak için soğuk lizis tamponu eklenir ve buz üzerinde 5 dk inkübe edilir.
İnkübasyon ardından steril hücre kazıyıcı veya pipet ucu kullanarak hücreler sıyırılır, pipetle yavaşça karıştırarak hücreler toplanır ve mikrosantrifüj tüpü içerisine koyulur.
Tüpler 10.000 G, 4 °C’de 10 dk santrifüj edilir.

*Kullanılan tampona veya kite göre santrifüj değerleri değişim gösterebilmektedir.

Santrifüj sonrası üstteki süpernatant dikkatlice yeni ve temiz bir tüpe aktarılır ve buza gömülür. Süpernatant DNA – RNA içermektedir.
Örnekler daha sonra kullanmak için ‑80°C'de saklanmalıdır.

Numunelerin Transferi:

Numuneleriniz uygun koşullarda şirketimiz tarafından transfer edilecektir. Şirketimiz numunelerin transferini 78.5°C sağlayan kurubuz ile yapmaktadır.

Süspanse Hücre Numune Alım Prosedürü

Hücreler %80 yoğunluğa ulaşınca toplanmalıdır.

Çalışma alanı, yüzeyi ve kullanılacak aletler çalışmaya başlamadan önce uygun sterilizasyon yöntemleri ile temizlenmeli ve steril hale getirilmelidir (alkol ile silme).

Çalışma sırasında eldiven kullanmak, önlük giymek gibi steril tekniklere dikkat etmek gerekmektedir aksi takdirde DNA‑RNA kontaminasyonu kaynaklı yanlış pozitif sonuçlar alınmaktadır.

Çalışmayı mümkünse buz üzerinde yapmanız önerilmektedir.

Çalışmaya başlamadan önce santrifüj 4 °C’ye soğutulmalıdır.

Hücrelerin ekili olduğu flask / petri kabı buz üzerine yerleştirilir.
Hücre süspansiyonu bol pipetaj yapılarak toplanır ve falkon tüpe aktarılır.

*Bu aşamada flask yüzeyinde bulunan tüm hücreler toplanmaya çalışılmalıdır.

Falkon santrifüje yerleştirilir ve 4 °C 2500G’de 5‑10 dk santrifüj edilir.
Santrifüj işlemi sonrası hücreler tüpün dibinde toplanacaktır (pellet) üstteki sıvı pellete dokunmamaya çalışarak dikkatlice atılır.

*Hücre pasajlama protokolünde uygulanılan süre ve RPM’de santrifüj işlemini gerçekleştirilebilir.

Test tüpü buz üzerine yerleştirilir, pellet soğuk PBS ile yeniden süspanse edilerek bir kez yıkanır.
Süspanse hücreler 4 °C 2.500G’de 5‑10 dk santrifuj edilir ve üstte bulunan sıvıyı atılır.
Test tüpü buz üzerine yerleştirilir, pellet üzerine lizis tamponu eklenir ve yukarı aşağı pipetaj yaparak hücreleri tekrar süspanse hale getirilir.
Hücre süspansiyonunu buz üzerinde 5‑10 dk bekletilir, hücrelerin parçalanması için ara ara çalkalanır.

*İnkübasyon süresi kullanılan lizis tamponuna bağlı olarak değişebilmektedir.

İnkübasyon süresi ardından hücre süspansiyonunu 4°C'de 10.000 G'de 10 dk santrifüjlenir.

*Kullanılan tampona veya kite göre santrifüj değerleri değişim gösterebilmektedir.

Santrifüj sonrası üstteki süpernatant dikkatlice yeni ve temiz bir tüpe aktarılır ve buza gömülür. Süpernatant DNA – RNA içermektedir.
Örnekler daha sonra kullanmak için ‑80°C'de saklanmalıdır.

Numunelerin Transferi:

Numuneleriniz uygun koşullarda şirketimiz tarafından transfer edilecektir. Şirketimiz numunelerin transferini 78.5°C sağlayan kurubuz ile yapmaktadır.

Detay

I.H.C. Numune Alım Prosedürü

Numune Alınmadan Önce:

- Deney hayvanına doku, graft, tümör, kök hücre vs. yerleştirilecekse yara bölgesi çözünmeyen sütür ile dört köşesinden işaretlenmelidir.
- Bu prosedür doku çıkartılırken hedef alanın bulunmasını ve x‑y‑z düzlemlerinde konumunun tespitini sağlayacaktır.
- İşaretlenme yapılırken mümkün olan en küçük alan tercih edilmelidir. Alanın küçük olması: 1‑Bloklanacak kasetin boyutunun standart olmasından; 2‑ Fiksatifin dokuya penetre olabilmesi için ideal doku boyutunun 1x1x1 cm yani 1 cm^3 olmasındandır.

Numune Alındıktan Sonra:

- Doku çıkartıldıktan sonra hedef alanın etrafındaki tüm fazla dokuların büyüteç altında küçültülmesi üstteki sebeplerden dolayı gereklidir. Fare beyni, karaciğeri vb. küçük organlar yaklaşık 1 cm^3 boyutunda olduklarından küçültülmeye ihtiyaç duymadan fiksatife konulabilir. Mide, bağırsak gibi boşluklu organların içine fiksatifin girmesi için organın yapısı bozulmadan bir‑iki noktadan delinmesi gerekmektedir. Bu işlemler sırasında doku PBS, serum fizyolojik gibi bir sıvı kullanılarak kurumasına izin verilmemelidir.
- Küçültme işlemi sırasında kullanılacak kesici materyal NEŞTER (SCALPEL) ya da TEK KULLANIMLIK TRAŞ JİLETLERİ olmalıdır. Diğer kesici materyaller yeteri kadar keskin olmadığından dokunun yapısının bozulmasına sebep olur. Kesme/küçültme işlemi tek seferde yapılmalıdır.
- Dokular küçültüldükten sonra kesit alınması istenen yüzey belirlenerek işaretlenmelidir.
- Kullanılacak fiksatif, %10’luk NBF (Neutral Buffered Formalin) olmalıdır.
- Tamponlu formalin pH dengesini koruyarak daha kaliteli sonuçlar elde edilmesini sağlar.
- İmmünohistokimya veya floresan çalışmalarında %10’luk NBF kullanılabilmekle birlikte daha kaliteli antijen korunumu için %4’lük PFA (paraformaldehit) tercih edilebilir.
- Trikrom gibi özel boyalar yapılacaksa fiksatif değişeceğinden öncesinde şirketimizden bilgi alınması gerekmektedir.
- Uygun olmayan fiksatiflerin kullanımı dokunun ve alınacak sonucun kalitesini etkiler.
- Fiksatif doku parçasının ortalama 10 katı hacminde olmalıdır.
- Doku alındıktan sonraki gün fiksatif yenilenmelidir.
- Küçük doku örneklerinde, çoğu rutin histolojik inceleme için 12‑24 saatlik fiksasyon yeterli olabilmektedir. Ancak uygun fiksasyon süresi; doku tipi boyutu, yoğunluğu, yağ oranı ve yapılacak analize göre değişmektedir.
- Sinir sistemi dokularında mutlaka tamponlu fiksatifler tercih edilmelidir. Özellikle beyin gibi yağ oranı yüksek dokularda uzun süreli fiksasyon doku sertliğini arttırabilir.
- Uzun süreli fiksasyon özellikle immünohistokimyasal çalışmalarda antijen maskelenmesine neden olabilmektedir.
- Embriyo, yeni doğmuş veya küçük hayvanlar veya büyü hacimli dokularda fiksatif penetrasyonunu arttırmak amacıyla örneğin iç bölgelerine enjektör yardımıyla fiksatif uygulanabilir.
- Dokular ve fiksatif aşağıdaki örnek resimde görülen sızdırmaz kapaklı kutulara konularak taşınmalıdır. Kapaklı kutular üzerine hastanın adı/hayvanın cinsi, dokunun adı, alındığı tarih, protokol numarası kabın üzerine kurşun kalemle yazılmalıdır.
- Retrospektif çalışma planlanıyorsa patoloji arşivinden alınan bloklar şirketimize teslim edilerek çalışma gerçekleştirilebilir.
- Fiksasyon işlemi ve süresi belirtilen kurallara uygun olarak GERÇEKLEŞTİRİLMEZSE histolojik, histokimyasal ve immünohistokimyasal sonuçların kalitesi garanti edilemez.

Numunelerin Transferi:

- Numuneleriniz uygun koşullarda şirketimiz tarafından transfer edilecektir.

Hücre kültürü numuneleri için:

- Hücre kültüründe immünofloresan yada immünperoksidaz boyanma planlanıyorsa uygun chamber slide lara hücreler ekilip deney uygulandıktan sonra, uygun fiksatifle (bu konuda şirketetimize danışılmalıdır!) tespit edildikten sonra kuru buz da şirketimize ulaştırılmalıdır.

İmmünofloresan ve immünperoksidaz işaretlemeler için kullanılacak antikorlar:

- Primer ve sekonder antikorlar dokuya, doku alınan canlıya ve birbirlerine uyumlu olmaları açısından firmamızın uzman ekibi tarafından seçilerek uygulanacaktır.
- Primer ve sekonder antikorlar hizmet alıcı tarafından belirlenip alındıktan sonra yapılacak işaretlemelerde sonuç garanti edilemez.

Detay

TAS TOS elisa reader çalışma prosedürü

https://ottoakademik.com/assets/dosyalar/ottopanel/dosya‑upload/tas‑tos‑kiti‑elisa‑reader‑calisma‑protokolu.pdf

Detay

TAS-TOS (Relassay) ÇALIŞMASI İÇİN HÜCRE KÜLTÜRÜ NUMUNE HAZIRLAMA YÖNTEMİ

TAS‑TOS (Relassay) ÇALIŞMASI İÇİN HÜCRE KÜLTÜRÜ NUMUNE HAZIRLAMA YÖNTEMİ

(1. Yöntem)

6’lık well plate içinde 1x106 hücre/well olacak şekilde ekilen ve daha sonra uygulama yapılan hücreler, uygulama sonrasında 1 ml soğuk PBS ve scraper yardımı ile kazınır. Daha sonra kalan hücreleri toplamak için 1 ml daha soğuk PBS ile hücreler kuyulardan 2 ml’lik ependorflara (tüplere) alınır. Tüpler buz üzerinde tutulmalıdır. Daha sonra tüpler 10.000 RPM’de +40 C’de 5 dakika santrifüj edilir. Tüplerdeki PBS çekilir ve atılır. Pelletin üzerine soğuk çözme tamponu eklenir. Tüpler buzda bekletilir. Pipetaj yapılır. Tüpler 10‑15 dakika buzda bekletilir. (Bu süre 30 dk ya kadar çıkarılabilir). Tüpler, her 5 dk’da bir vortekslenir. Daha sonra 10.000 G’de 30 dakika +4 C’de santrifüj edilir. Süpernatant temiz bir tüpe alınır ve pellet atılır. Süpernatant kısmından TAS‑TOS seviyesine bakılır.

Çözme tamponu hazırlanışı (10 ml) pH=7,8

1M Tris Buffer (10 mL) pH:7,2

‑1,21 g Tris

‑3 mL ddH2O ile çözülür. HCl ile pH ayarlaması yapılır. 10 mL’ye ddH2O ile tamamlanır.

2M NaCl (50 mL)

‑5,85 g NaCl tartılır

‑50 mL ddH2O ile çözülür.

1M MgCl2 (10 mL)

‑2,03 g MgCl2 tartılır.

‑10 mL ddH2O ile çözülür.

TAS‑TOS için çözme tamponu (10 mL)

‑1M Tris Buffer (10 mL) pH:7,2’den 100 µl,

‑2M NaCl’den 5 mL

‑1M MgCl2 (10 mL)’den 500 µl,

‑Triton X‑100’den 100 µl alınır.

‑10 mL’ye ddH2O ile tamamlanır.

‑pH 7,8’ ayarlanır.

(2. Yöntem)

HÜCRE KÜLTÜRÜNDE TAS, TOS

*Hücre kültürü çalışmalarında hücre kültür mediumu solusyonu ayrı ve hücre lizatları ayrı çalışılır.

Hücre Kültür Mediumu Çalışması

Hücrelerin üzerindeki medium (hücrelerin üzerinden toplanan sıvı besiyeri ) falkona aktarılarak ya hemen ya da ‑20/‑80°C’de saklanıp direk olarak (serum gibi) çalışılır.

Hücre Lizatları Çalışması

Hücreler tripsin‑EDTA ile kaldırılmadan önce pH7.4, 100mM PBS ile 1 defa yıkanır (yıkama hacmi 5mL) ve üstteki sıvı atılır.

Flaska tutunan hücreleri kaldırmak için flask içerisine %0.05 Tripsin içeren Tripsin‑EDTA solüsyonundan 2mL eklenir (tripsin aktivitesinin artması için flask inkübatöreyerleştirilebilir).

Birkaç dakika (1‑5 dk) sonra hücreler flasktan ayrılır. Hücreler ortamdan kolay kalkmadığı durumlarda elle flaska vurularak kaldırılabilir.

Tripsinin inhibisyonu için 6mL fullbesiyeri (%10 FBS, %1 Penisilin streptomisin,%1 L‑Glutamin içeren highglucose DMEM) flask içerisine eklenir. Sonra bu karışım falkona aktarılıp 1800 rpm 5dk santrifüj edilir.

Santrifüj sonunda alttaki pellet bozulmayacak şekilde süpernatantın hepsi atılır. (Pellette yaklaşık 1*106 hücre vardır ve bir kırmızı mercimek büyüklüğündedir, bu değer 75 ml lik flask değeridir).

Hücrelere sayma işlemiyapılır.

Pelletten hücre lizatının (hücreler parçalandıktan sonra santrifüj sonrası elde edilen süpernatant) elde edilmesi:

Pellet üzerine 500 mikrolitre, 140 mM KCl çözeltisi eklenip hücreler homojenize edilir.

Daha sonra hücreler sonikatörde birkaç dakika parçalanır.

15 dk 14000 rpm’de santrifüj edilir ve süpernatant ya hemen çalışılır/ ya da çalışılmak için ‑20/‑80°C derin dondurucuya kaldırılır.

Hücrelerin üzerinden toplanan Mediumda; TAS, TOS sonuçları tıpkı serum örneğindeki gibi medium hacmi başına verilir.

Hücre lizatının süpernatantında; TAS,TOS ve mikroprotein düzeyi ölçülür. Sonuçlar hücre lizatının mg protein başına ya da hücre başına (örneğin 0,5 ml de bir milyon hücre varsa bir litrede 2 milyar hücre vardır) verilir.

*Hücre Kültür Mediumu Çalışmasında fenol red’den gelen rengi ekarte etmek için ikinci dalga boyu olarak 570 nm seçilir.

**Hücre lizatları için bu nm de ikincil dalga boyu seçilmesine gerek yoktur.

Detay

TAS_TOS_OSI_Hesaplama manuel hesaplama formülü

Kitleri çalıştıktan sonra elde etmiş olduğunuz absorbansları formüle koyduğunuzda otomatik olarak hesaplar.

https://ottoakademik.com/assets/dosyalar/ottopanel/dosya‑upload/tas‑tos‑osi‑hesaplama‑manuel‑hesaplama‑formul.xlsx

Detay

Test metodları

ELISA:

This assay is based on the sandwich ELISA technique. The wells of the provided microplate are pre‑coated with an antibody that specifically recognizes (human,rat etc.) (name of parameter). Standards and samples are introduced into the wells, where the target antigen binds to the immobilized antibody. Following this step, a biotin‑labeled detection antibody specific to (human,rat etc.) (name of parameter)is added, forming an antibody–antigen–antibody complex. Subsequently, Avidin conjugated with Horseradish Peroxidase (HRP) is introduced and binds to the biotinylated antibody. After incubation, any unbound substances are removed through washing. A substrate solution is then added to each well. In the presence of the HRP enzyme, a colorimetric reaction occurs, producing a blue color. The reaction is stopped by adding a stop solution, which changes the color from blue to yellow. The absorbance is measured at 450 nm (±2 nm) using a spectrophotometer. The intensity of the color is directly proportional to the concentration of (human,rat etc.) (name of parameter)in the sample. The concentration of the analyte can be determined by comparing the sample absorbance values to a standard calibration curve.

COLORIMETRIC:

TOTAL ANTIOXDANT STATUS (TAS) (mmol/L)

TAS levels were measured using commercially available kits (Relassay, Turkey). The novel

automated method is based on the bleaching of characteristic color of a more stable ABTS

(2,2 ′ ‑ Azino‑bis(3‑ethylbenzothiazoline‑6‑sulfonic acid)) radical cation by antioxidants. The

assay has excellent precision values, which are lower than 3%. The results were expressed as

mmol Trolox equivalent/L (Erel O. A novel automated direct measurement method for total

antioxidant capacity using a new generation, more stable ABTS radicalcation. Clin Biochem

2004;37:277‑85.)

(Relassay,Turkey)

Erel O. A novel automated method to measure total antioxidant response against potent free radical reactions. Clin Biochem. 2004 Feb;37(2):112‑

TOTAL OXIDANT STATUS (TOS) (µmol/L)

TOS levels were measured using commercially available kits (Relassay, Turkey. In the new

method, oxidants present in the sample oxidized the ferrous ion‑o‑dianisidine complex to

ferric ion. The oxidation reaction was enhanced by glycerol molecules abundantly present in

the reaction medium. The ferric ion produced a colored complex with xylenol orange in an

acidic medium. The color intensity, which could be measured spectrophotometrically, was

related to the total amount of oxidant molecules present in the sample. The assay was

calibrated with hydrogen peroxide and the results were expressed in terms of

micromolar hydrogen peroxide equivalent per liter (μmol H2O2 equivalent/L). ( Erel O. A

new automated colorimetric method for measuringtotal oxidant status. Clin Biochem

2005;38:1103‑11. ).

(Relassay,Turkey)

Erel O. A new automated colorimetric method for measuring total oxidant status. Clin Biochem. 2005 Dec;38(12):1103‑11.

OXIDATIVE STRESS INDEX (OSI)

The ratio of TOS to TAS was accepted as the oxidative stress index (OSI). For calculation, the

resulting unit of TAS was converted to μmol/L, and the OSI value was calculated according to

the following Formula : OSI (arbitrary unit) =

TOS (μmol H2O2 equivalent/L) / TAC (μmol Trolox equivalent/L). (1‑3).

1. Yumru M, Savas HA, Kalenderoglu A, Bulut M, Celik H, Erel O. Oxidative imbalance in

bipolar disorder subtypes: a comparative study. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry.

2009 Aug 31;33(6):1070‑4.

2. Kosecik M, Erel O, Sevinc E, Selek S. Increased oxidative stress in children exposed to

passive smoking. Int J Cardiol 2005;100:61–4.

3. (Harma M, Harma M, Erel O (2003) Increased oxidative stress in patients with

hydatidiform mole. Swiss Med Wkly 133:563‑536).

Catalase (CAT) U/L

This colorimetric assay involves two steps. Sample is first incubated with a known amount of

hydrogen peroxide. Sample converts hydrogen peroxide to water and oxygen. The ratio is

proportional to the concentration of catalase. The enzyme is stopped and the remaining

hydrogen peroxide, following a fixed incubation period, is determined using a chromogen.

The resulting absorbance is measured at 405 nm and the obtained results are expressed as U/L.

(Relassay, Turkey)

Góth L. A simple method for determination of serum catalase activity and revision of reference range. Clin Chim Acta. 1991 Feb 15;196(2‑3):143‑151.

Thiol/Disulfide Homeostasis (µmol/L)

Tests were measured using a novel automatic and spectrophotometric method developed by Erel and Neselioglu*

which is avaliable commercially (Rel Assay Diagnostics, Turkey) In this method, dynamic and reducible disulfide bonds

in the samples were reduced to free functional thiol groups by using sodium borohydride. In order to prevent the reduction

of unused reduced sodium borohydride to dithionite‑2 nitrobenzoic (DTNB), NaBH4 was removed with formaldehyde. Native thiol (NT) and total thiol (TT)

levels were determined after reaction with DTNB and their levels were measured ultimately. Half of the difference of the result obtained

by the subtraction of native thiol amount from total thiol content indicated the disulfide (DS) level.

(Relassay, Turkey)

Erel O, Neselioglu S. A novel and automated assay for thiol/disulphide homeostasis. Clin Biochem. 2014 Dec;47(18):326‑32. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2014.09.026. Epub 2014 Oct 7. PubMed PMID: 25304913.

Paraoxonase‑1 PON‑1) U/L

Measurement of paraoxonase activity;

Paraoxonase activity was measured using

commercially available kits (Relassay, Turkey).

The rate of paraoxon hydrolysis (diethylpnitrophenylphosphate)

was measured by monitoring the increase of

absorption at 412 nm at 37 °C. The amount of generated p‑nitrophenol

was calculated from the molar absorption coefficient at pH 8.5, which

was 18.290 M−1 cm−1 Paraoxonase activity was expressed as U/L serum

(Relassay, Turkey)

Myeloperoxidase (MPO) U/L

MPO posseses various catalytical activities. It exhibits the main catalytical activity by the

production of hypochlorous acid (HClO) from hydrogen peroxide (H2O2) and chloride anion,

Cl‑ (or halide). MPO also exhibits peroxidase activity that catalyzes oxidation of a number of

substrates by H2O2. These reactions categories have been widely used to assess the

activities of MPO.

The Relassay Myeloperoxidase Chlorination Activity Assay Kit and The Relassay

Myeloperoxidase Peroxidation Activity Assay Kit are quantitative and colorimetric assay kits

for measuring the myeloperoxidase activity within a sample. In the The Relassay

Myeloperoxidase Chlorination Activity Assay Kit, MPO catalyzes the formation of

hypochlorous acid, which reacts with taurine to form taurine chloroamine. Taurine chloroamine reacts with the chromophore TNB, resulting in the formation of the colorless

product DTNB. One unit of MPO activity is defined as the amount of enzyme that hydrolyzes

the substrate and generates taurine chloramine to consume 1.0 μmole of TNB per minute.In

the The Relassay Myeloperoxidase Peroxidation Activity Assay Kit, MPO catalyzes odianisidine

to colored o‑dianisidyl radical using H2O2. The increasing absorbance is

monitored at 412 nm and the activity is measured kinetically. This kit can be used manually

and easily adapted to automated analyzers.

(Relassay, Turkey)

1‑ Kusuma KS*, Vasudha KC, Vanitha Gowda MN. A Comparative Study of Serum Myeloperoxidase Activity in Type 2 Diabetes and Diabetic Nephropathy. Biomedical Research (2009) Volume 20, Issue 3: 198‑204

2‑ Krueger AJ, Yang JJ, Roy TA, Robbins DJ, Mackerer CR. An Automated Myeloperoxidase Assay. Clin Chem 1990;36:158

3‑ Worthington Enzyme Manual. Freehold, NJ: Worthington Biochemical Corp;1972.43‑55.

Zinc (ZN) μg/dl

Zinc found in the samples change the red‑orange color of 5‑Br‑PAPS to light pink under alkaline conditions.

The change of absorbance at 548 nm is proportional to total zinc level in the sample.

The assay can be calibrated with zinc sulfate dissolved in deionized water.

(Relassay, Turkey)

Copper (CU) μg/dl

Copper found in the samples change the red‑orange color of DiBr‑PAESA to violet under acidic conditions.

The change of absorbance at 572 nm is proportional to total copper concentration in the sample.

The assay can be calibrated with copper sulfate dissolved in deionized water.

(Relassay, Turkey)

Paraoxonase and Arylesterase activities;

Paraoxonase and arylesterase activities were measured using

commercially available kits (Relassay, Turkey).

The rate of paraoxon hydrolysis (diethylpnitrophenylphosphate)

was measured by monitoring the increase of

absorption at 412 nm at 37 °C. The amount of generated p‑nitrophenol

was calculated from the molar absorption coefficient at pH 8.5, which

was 18.290 M−1 cm−1 Paraoxonase activity was expressed as U/L

serum. Phenylacetate was used as a substrate to measure the

arylesterase activity. Enzymatic activity was calculated from the molar

absorption coefficient of the produced phenol, 1310 M−1 cm−1. One unit

of arylesterase activity was defined as 1 μmol phenol generated per

minute under the above conditions and expressed as U/L

(Relassay, Turkey)

Ischemia Modified Albumin (IMA)

The colorimetric assay format quantitatively measures

unbound cobalt remaining after cobalt‑albumin binding

has occurred. Thus, with reduced cobalt‑albumin binding,

there is more free, unbound cobalt detected, resulting

in elevated assay levels.

Glutathione Peroxidase (GPx) (U/L)

This method is based on that of Paglia and Valentine. Glutathione Peroxidase (GPx) catalses of the

oxidation of glutathione by cumene hydroperoxide. In the presence of glutathione (GSSG) is

immediately converted to the reduced form with a concomitant oxidation of NADPH to NADP. The decrease in absorbance at 340 nm is measured

Referanslar

Paglia, D.E. and Valentine, W.N., J. Lab. Clin. Med., 1967; 70: 158.

Prohaska, J.R., Oh, S.H., Hoekstra, W.G. & Ganther,

H.E. Biochem. & Biophys. Res. Comm. 1977; 74: 64.

Kraus, R.J. & Ganther, H. E. Biochem. & Biophys. Res. Comm 1980; 96: 1116.

Otto Scientific Cat.No. Otto2085

Malondialdehyde (MDA) nmol/L

The MDA level was determined by a method based

on the reaction with thiobarbituric acid (TBA) at 90–100_C

. In the TBA test reaction, MDA or MDA‑like

substances and TBA react with the production of a pink

pigment with a maximum absorption at 532 nm. The

reaction was performed at pH 2–3 at 90_C for 15 min. The

sample was mixed with two volumes of cold 10% (w/v)

trichloroacetic acid for the precipitation of protein. The

precipitate was pelleted by centrifugation, and an aliquot of

the supernatant was reacted with an equal volume of 0.67%

(w/v) TBA in a boiling water bath for 10 min. After

cooling, the absorbance was read at 532 nm.

Otto Scientific Cat.No. Otto1001

Micro Protein mg/dL

Bradford yöntem

Dokular 1:9 oranında (örnek 0.1 gr doku, 0.9ml tampon) fosfat tamponunda (50 mmol. lık pH:7.40 Fosfat Tamponu) homojenize edildi, 7000 rpm +4°C'de 5 dk. santrifüj edildi.

Nitric Oxide (NO) (µmol/L)

NO is easily oxidized to form N0² in vivo or in aqueous solution, and a reddish azo compoun is formed with the color developing agent, and the concentratıon of the azo compound is linearly related to the concentration of NO.

The concentration of NO can be calculated indirectly by measuring the OD value at 550 nm.

Protein Carbonyl nmol carbonyl/mg.

Protein carbonyl groups are a significant biomarker of oxidative stress. The DNPH tagging of protein carbonyls has become one of the most common methods for measuring oxidative stress.

The resulting DNP hydrazones from this reaction can be easily quantified at 375 nm.

Super Oxide Dismutase (SOD) U/ml

The role of superoxide dismutase (SOD) is to accelerate the reaction that converts the toxic superoxide radical (O2•), produced in oxidative energy processes, into hydrogen peroxide and molecular oxygen.

This method uses xanthine and xanthine oxidase (XOD) to generate superoxide radicals, and these radicals react with 2‑(4‑iodophenyl)‑3‑(4‑nitrophenyl)‑5‑phenyltetrazolium chloride (INT) to form a red formazan dye.

Superoxide dismutase activity is measured in a fully automated device using the reaction type endpoint 505 nm.

Total Glutathione and GSSG

Total GSH were determined by the method

described by Alisik et al. [M. Alisik, S. Neselioglu, O. Erel, A colorimetric method to measure oxidized,

reduced and total glutathione levels in erythrocytes, J. Lab. Med. 43 (5) (2019)

269–277]. GSH levels of supernatant samples were

measured using the Ellman method that was using 500 mM Tris solution

(pH: 8.2).

Detay

Biyokimya Test Prensipleri

Albumin g/dl

Colorimetric assay, endpoint method

• Sample and addition of R1

• Start of the reaction:

At a pH value of 4.1 albumin displays a sufficiently cationic character to be able to bind with bromocresol green (BCG), any anionic dyestuff, to form a blue‑green complex.

pH 4.1 albumin + BCG albumin BCG‑ complex

The color intensity of the blue‑green color is directly proportional to the albumin concentration and can be determined photometrical

Alkaline Phosphatase (ALP) U/L

Colorimetric assay in accordance with a standardized method.

ALP, Mg2

p ‑ Nitrophenylphosphate+ H2O Phosphate + p ‑ Nitrophenol

In the presence of magnesium and zinc ions, p‑nitrophenyl phosphate is hydrolyzed by phosphatases to form phosphate and p‑nitrophenol.

In this process AMP serves as transient phosphate acceptor. The release of coloured p‑nitrophenol is proportional to the ALP activity and can be measured photometrically.

Alpha Amylase

Colorimetric test with 2‑chloro‑4‑nitrophenyl‑a‑D‑maltotriose (CNP‑G3) as direct substrate. Colour is released directly as a result of a cleavage at the a‑glycone:

CNP ‑ G3 a‑amylase CNP + G3

(CNP = chloro‑nitrophenol; G = glucose)

The increase of absorption of chloro‑nitrophenol is directly proportional to the a‑ amylase concentration. The hydrolysis pattern in the formulation of the reagent show about less than 10 % CNP‑G2 and less than 1% CNP‑G4 as by products.

Amylase U/L

Colorimetric test with 2‑chloro‑4‑nitrophenyl‑a‑D‑maltotriose (CNP‑G3) as direct substrate. Colour is released directly as a result of a cleavage at the a‑glycone:

CNP ‑ G3 a‑amylase CNP + G3

(CNP = chloro‑nitrophenol; G = glucose)

AST U/L

UV test according to a standarrized method

Sample and addition of R1 (buffer)

Addition of R2 and start of reaction: AST

α‑ketoglutarate + L‑aspartate L‑ glutamate + oxaloasetate

AST is the enzyme which catalyzes this equilibrium reaction. The oxaloacetate in‑ crease is measured in a subsequent indicator reaction which is catalyzed by malate dehydrogenase.

MDH

oxalacetate + NADH + H+ L‑Malate + NAD+

In the second reaction, NADH is oxidized to NAD. The rate of decrease in NADH

(Measured photometrically) is directly proportional to the rate of formation of

oxaloasetate, and thus the AST activity.

ALT U/L

UV test according to the IFCC method.

ALT

L‑Alanin + 2‑Oxoglutarate ⎯⎯ L‑Glutamate + Pyruvat

LDH Range:20‑4000 U/L

Pyruvat + NADH + H+ ⎯⎯ D‑Lactate+ NAD+

The enzyme alanine aminotransferase (EC 2.6.1.2; L‑Alanine:2‑Oxoglutarate Aminotransferase,

ALT or A1aAT; Glutamate Pyruvate Transaminase, GPT) catalyzes the tran‑ saminase reaction between L‑Alanine and 2‑Oxoglutarate.

The pyruvate formed, is reduced to lactate in the presence of LDH. As the reactions proceed,

NADH is oxidized to NAD+. The disappearance of NADH per unit time is followed by measuring the decrease in absorbance at 340 nm.

Bilirubin Directmg/dl

Jendrassik‑Gróf method

In the presence of caffeine accelerator, total bilirubin couples with sulfanilic acid to form a red azobilirubin dye,

the color intensity which is proportional to the bilirubin concentration. Determination of direct bilirubin is performed without caffeine additive.

The addition of alkaline tartrate causes a transformation from the red azobilirubin dye to a blue dye and the absorbance maximum from 546nm to 578nm.

HCl

Sulfanilic acid+NaNO2 diazotized Sulfanic acid

HCl

Bilirubin + diazotized Sulfanic acid azobilirubin

Bilirubin Total mg/dl

Jendrassik‑Gróf method

In the presence of caffeine accelerator, total bilirubin couples with sulfanilic acid to form a red azobilirubin dye,

the color intensity which is proportional to the bilirubin concentration. Determination of direct bilirubin is performed without caffeine additive.

The addition of alkaline tartrate causes a transformation from the red azobilirubin dye to a blue dye and the absorbance maximum from 546nm to 578nm.

HCl

Sulfanilic acid+NaNO2 diazotized Sulfanic acid

HCl

Bilirubin + diazotized Sulfanic acid azobilirubin

Calciummg/dl

Calcium in the sample reacts with arsenazo III forming a coloured complex that

can be measured by spectrophotometry.

Cholinesterase U/L

Cholinesterase (CHE) catalyzes the hydrolysis of butyrylthiocholine to thiocholine and butyric acid.

The catalytic concentration is determined from the rate of decrease of hexacyanoferrate (III), measured at 405 nm, by means of the following reactions

CHE

Butyrylthiocholine + H2O Thiocholine + Butyric acid

2 Thiocholine + 2 OH‑ + 2 Hexacyanoferrate (III) Dithiobis(choline) + 2 Hexacyanoferrate (II) + H2O

The atypical isoenzyme of cholinesterase (AA) can be estimated through the “dibucaine number” indicating the inhibition of enzyme activity in the presence of dibucaine and expressed in per cent

Clolesterol Totalmg/dl

Cholesterol ester + H2O Cholesterol + fatty acids

Cholesterol esters are ceaved by the action of choesterol esterase to yield free

choesterol and fatty acids Cholesterol oxidase Cholesterol + O2 Cholesten‑3‑on + H2O2

Peroxidase

2H2O2 + Phenol + 4‑Aminoantipyrine Quinoneimine dye + 4 H2O

Cholesterol is converted by oxygen with the aid of cholesterol oxidase to A4‑ Cholestenone and hydrogen peroxide.

Hydrogen peroxide created forms a red dyestuff by reacting with 4‑aminoantipyrine and phenol under the catalytic action of peroxidase.

The color intensity is directly proportional to the concentration of cholesterol and can be determined photometrically.

Creatine Kinase Range: 5‑2500U/l

UV Test

• Sample and addition of R1

• Addition of R2 and start of reaction: CK Creatine phosphate + ADP Creatine + ATP HK ATP + glucose Glucose‑6‑phosphate + ADP G6PDH Glucose‑6‑P + NADP Gluconate‑6‑P + NADPH+H+

Equimolar quantities of NADPH and creatine are formed at the same rate. The photometrically measured rate of formation of NADPH is proportional to the CK activity.

CK‑MB U/l

Immunological UV assay

• Sample and addition of R1 (buffer/enzymes/coenzyme/antibody)

• Addition of R2 (buffer/substrate) and start of reaction.

Human CK‑MB is composed of two subunits, CK‑M and CK‑B which both have an active site.

With the aid of a polyclonal antibody to CK‑M, the catalytic activity of CKM subunits in the sample is inhibited to 99.6% without affecting the CK‑B subunits.

The remaining CK‑B activity, corresponding to half the CK‑MB activity, is determined by the CK‑MB method analogous to total CK.

As the CK‑BB isoenzyme only rarely appears in serum and the catalytic activity of the CK‑M and CK‑B subunits hardly differ, the catalytic activity of the

CK‑MB isoenzyme can be calculated from the measured CK‑B activity by multiplying the result by

CRP (C‑Reactive Protein) mg/L

Immunoturbidimetric assay

Anti‑CRP antibodies react with antigen in the sample to form an ntigen/antibody complex. Following agglutination, this is measured turbidimetrically.

Addition of PEG allows the reaction to progress rapidly to the end point,increases sensitivity, and reduces the risk of samples containing excess antigen producing false negative results.

Creatininemg/L

Immunoturbidimetric assay

Anti‑CRP antibodies react with antigen in the sample to form an ntigen/antibody complex. Following agglutination, this is measured turbidimetrically.

Addition of PEG allows the reaction to progress rapidly to the end point,increases sensitivity, and reduces the risk of samples containing excess antigen

producing false negative results.

Ferritinug/L

Serum ferritin causes agglutination of latex particles coated with anti‑human ferritin antibodies.

The agglutination of the latex particles is proportional to the ferritin concentration and can be measured by turbidimetry.

GGT (Gamma GT)U/l

Enzymatic colorimetric assay

• Sample and addition of R1 (Buffer/Glycylglycine)

• Addition of R2 (substrate) and start of reaction Gamma‑glutamyltransferase transfers the g‑glutamyl group of L‑g‑glutamyl‑3‑

carboxy‑4‑nitroanilide to glycylglycine. The amount of 5‑amino‑2‑nitrobenzo‑nate liberated is proportional to the GGT activity and can be determined photo‑metrically.

Glucose mg/dl

Enzymatic colorimetric test on basis of Trinder – Reaction:

Glucose oxidase Glucose + O2 Gluconic acid + H2O2

Peroxidase

2H2O2 + Phenol + 4–Aminoantipyrine Red Quinoneimine + 4H2O

(Otto Scientific)

HbA1c %

The principle of the test is latex agglutination method that measures the ratio of hemoglobin A1C that occupy in total hemoglobin in the whole blood.

The sample (hemolysis sample) is added to the sensitized latex particles, and the surface of the latex adsorbs total hemoglobin in the sample.

Anti‑human HbA1c Mouse monoclonal antibody complex agglutination by anti‑mouse IgG antibody. At this time, the amount of agglutination caused

depends on the amount of HbA1c that adsorbs the surface of the latex, this this agglutination is measured as a turbidity.

The concentration of HbA1c (%) in the sample is determined by referring to the calibration curve obtained by the same test of diluted standard solutions.

HDL Cholesterol mg/dl

Enzymatic colorimetric test

• Sample and addition of R1

• Addition of R2 and start of reaction

In the first step LDL, VLDL and Chylomicrons are eliminated and transformed to

non reactive compounds and specific condition for the reaction. By the second

reagent only the HDL‑Cholesterol is subject to color reaction

Cholesterol Esterase

Cholesterol ester + H2O Cholesterol + fatty acid

Cholesterol Oxidase

Cholesterol + O2 Cholesten‑3‑on + H2O2

Peroxidase

H2O2 + phenol + 4‑aminoantipyrine quinoneimine dye+4 H2O

LDL Cholesterolmg/dl

İlk adımda, HDL, VLDL ve Şilomikronlar elimine edilir ve reaksiyon için özel koşulda reaktif olmayan bileşiklere dönüştürülür. İkinci reaktif sadece LDL‑kolesterol renk reaksiyonudur.

Kolesterol esteraz

Kolesterol ester + H2O kolesterol + yağ asidi

Kolesterol Oksidaz

Kolesterol + O2 kolesten‑3‑on + H2O2

peroksidaz

H2O2 + fenol + 4‑ aminoantipirin kinon boyası +4 H2O

lgA mg/dL

Immunoglobulins A (IgA) selectively react with an anti‑IgA antibody and form an immunocomplex.

The produced turbidity is proportional to the concentration of IgA in the sample, and can be measured at the wavelenght of 600 nm

lgE IU/mL

Anti‑human IgE antibodies when mixed with samples containing IgE, form insoluble complexes.

These complexes cause an absorbance change, dependent upon the IgE concentration of the patient sample,

that can be quantified by comparison from a calibrator of know IgE concentration.

lgG mg/dL

Immunoglobulins G (IgG) selectively react with an antiIgG antibody and form an immunocomplex.

The produced turbidity is proportional to the concentration of IgG in the sample, and can be measured at the wavelenght of 600 nm

lgM mg/dL

Immunoglobulins M (IgM) selectively react with an antiIgM antibody and form an immunocomplex.

The produced turbidity is proportional to the concentration of IgM in the sample, and can be measured at the wavelenght of 340 nm.

Lipase U/l

Enzymatic colorimetric assay;

• Sample and addition of R1 (buffer/colipase/cholate)

• Addition of R2 (emulsion/chromogenic substrate/cholate) and start of reaction:

lipase

1,2‑O‑dilauryl‑rac‑glycero‑3‑ 1,2‑O‑dilauryl‑rac‑glycerol +

glutaric acid‑(6‑methylresorufin)ester glutaric acid‑(6‑methylresorufin)ester

spontaneous

glutaric acid‑ glutaric acid + methylresorufin

(6‑methylresorufin) ester decomposition

The chromogenic lipase substrate 1,2‑O‑dilauryl‑rac‑glycero‑3‑glutaric acid‑(6‑

methylresorufin) ester is cleaved by the catalytic action of alkaline lipase solution to form 1,2‑O‑dilauryl‑rac‑glycerol and an unstable intermediate,

glutaric acid‑(6‑ methylresorufin) ester. This decomposes spontaneously in alkaline solution to form glutaric acid and methylresorufin.

The colour intensity of the red dye formed is directly proportional to the lipase activity and can be determined photometrically.

MagnesiummEq/l

Colorimetric endpoint method

Sample and addition Reagent start of reaction:

In alkaline solution, magnesium forms a purple complex with xylidyl blue, a

diazonium salt. The magnesium concentration is measured photometrically via the decrease in the xylidyl blue absorbance.

(Otto Scientific)

Phosphorusmg/dl

Inorganic phosphate forms an ammonium phosphomolybdate complex having the formula(NH4)3[PO4(MoO3)12] with ammonium molybdate in the presence of sulfuric acid.

The complex is determined photometrically in the ultraviolet region (340 nm).

RF (Rheumatoid Factor) IU/ml

Particle enhanced immunoturbidimetric assay.

Sample and addition of R1 (buffer)

Addition of R2 (latex‑bound IgG/buffer) and start of reaction.

Latex‑bound heat‑inactivated IgG (antigen) reacts with the RF‑antibodies in the sample to form antigen/antibody complexes. Following agglutination is measured turbidimetrically.

Total Protein g/dl

Colorimetric assay, Sample and addition of Reagent start of the reaction:

Divalent copper reacts in alkaline solution with protein peptide bonds to form the characteristic purple‑colored biuret complex.

Sodium potassium tartrate prevents the precipitation of copper hydroxide and potassium iodide prevents auto reduction of copper. alkaline protein + Cu2+ solution Cu‑protein complex

The color intensity is directly proportional to the protein concentration which can be determined photometrically.

Triglyceridesmg/dl

Triglycerides in the sample originates, by means of the coupled reactions described below, acoloured complex that can be measured by spectrophotometry.

Triglycerides + H2O lipase Glycerol + Fatty acids

Glycerol + ATP glycerol kinase Glycerol – 3 – P + ADP

Glycerol – 3 –P + O2 G‑3‑P‑oxidase Dihidroxyacetone – P +H2O2

2 H2O2 + 4 – Aminoantipyrine + 4 – Chlorophenol G‑3‑P‑oxidas Quinoneimine + 4 H2O

UIBC μg/dl

Photometric test using chromagen ferrozine.

Total Iron‑Binding Capacity(TIBC): A known amount of ferrous ions are added to serum at an alkaline pH.

The ferrous ions bind with transferrin at unsaturated iron‑binding sites. The additional unbound ferrous ions are measured using the ferrozine reaction.

The difference between the amount of ferrous ions ions added and the unbound ions measured is the unsaturated iron‑binding capacity (UIBC). The TIBC is equal to the serum iron concentration plus the UIBC.

Urea (BUN)mg/dl

Urea is hydrolysed in presence of urease to produce ammonia and CO2. The ammonia produced combines with 2 – oxoglutarate and NADH in presence of GLDH to yield glutamate and NAD.

urease

Urea+H2O+2H+ 2 NH4+ + 2+ CO2

GLDH

2 NH4+ + 2‑Oxoglutarate + 2 NADH H2O + 2 NAD+ + Gl utamate The decrease in absorbance due to consumption of NADH is measured kinetically.

Uric Asitmg/dl

Colorimetric endpoint assay

Uricase

Uric acid + 2 H2O + O2 Allantoin + CO 2 + H 2O 2

Uricase cleaves uric acid to form allantoin and hydrogen peroxide.

POD

2H2O2 + 4H+ + phenole + 4‑aminoantipyrine quinonimine dye + 4H2O

The increase in absorbance is measured.

HbA1c

The principle of the test is latex agglutination method that measures the ratio of hemoglobin A1C that occupy in total hemoglobin in the whole blood.

The sample (hemolysis sample) is added to the sensitized latex particles, and the surface of the latex adsorbs total hemoglobin in the sample.

Anti‑human HbA1c Mouse monoclonal antibody complex agglutination by anti‑mouse IgG antibody. At this time, the amount of agglutination caused depends

on the amount of HbA1c that adsorbs the surface of the latex, this this agglutination is measured as a turbidity.

The concentration of HbA1c (%) in the sample is determined by referring to the calibration curve obtained by the same test of diluted standard solutions.

Iron (FE) (μg/dl)

Colorimetric assay pH < 2,0 Transferrin‑Fe‑complex apotransferrin + Fe3+ ascorbate Fe3+ Fe2+ FerroZine® + Fe2+ colored complex Under acidic conditions,

iron is liberated from transferrin. Lipemic samples are clarified by the detergent. Ascorbate reduces the released Fe3+ ions to Fe'2+ ions which react with

FerroZine to form a colored complex. The color intensity is directly proportional to the iron concentration and can be measured photometrically.

Potassium

Ion Selective Electrode (ISE)

Sodium

Ion Selective Electrode (ISE)

Potassium (K)

Potassium Assay Kit is an assay kit is an Assay Kit by Colorimetric Method designed for the detection and quantification of Potassium concentrations.

Sodium (Na)

Sodium Assay Kit (Colorimetric) provides a convenient two‑step method to detect sodium ions (Na ) present in serum, urine and saliva. In this assay,

sodium ions present in the sample are used by the enzyme β‑galactosidase to produce an intermediate product, which reacts with a developer to generate a color signal that can be detect at OD = 405 nm.

ICP‑MS

An ICP‑MS instrument uses a plasma (ICP) to ionize the elements in a sample and then measures the ions using a mass spectrometer (MS)

Perkin Elmer NexION 2000‑c

NEFA

Enzymatic endpoint method

Non‑esterified fatty acids and coenzyme A react in the presence of acyl coenzym A synthetase (ACS) to acylated coenzyme A.

Subsequent oxidation of the acylated coenzyme A by acyl‑CoA oxidase releases H2O2. H2O2 is converted to a colored product by the use of Trinder substances in the presence of peroxidase (POD).

ACS

NEFA + Coenzyme A + ATP ◄─────► Acyl‑CoA + AMP + PPi

ACOD

Acyl‑CoA + O2 ◄─────► 2,3‑Trans‑enoyl‑CoA + H2O2

POD

2 H2O2 + Trinder ◄─────► Dye + 4 H2O

At 546 nm the intensity of the red dye is directly proportional to the concentration of free fatty acids in the sample.

BHBA

Enzymatic determination with β‑hydroxybutyrate‑dehydrogenase

β‑Hydroxybutyrate in presence of NAD+ is converted to acetoacetate and NADH + H+ by β‑hydroxybutyrate‑dehydrogenase. The absorbance at 340 nm is proportional to the β‑hydroxybutyrate concentration in the sample.

β‑Hydroxybutyrate‑dehydrogenase

β‑Hydroxybutyrate + NAD ───────► Acetoacetate + NADH + H+

Detay

Realtime PCR Analizi Nasıl Yapılır (Protokol)

REAL TIME PCR PROTOCOL

RNA Isolation

Doku numunelerinden total RNA eldesi Trizol Reagent (Invitrogen, 15596026) kullanılarak gerçekleştirildi.

100 mg doku tartıldı, üzerine 1 ml TRIzol eklendi ve homojenize edildi.
7000 RPM, 4°C’de 5 dk santrifuj edilidi.
Süpernatant oda ısısında 5 dk inkübe edildi.
0.2 ml Kloroform eklendi, vortexlendi ve 2‑3 dk inkübe edildi.
İnkübasyon ardından 12.000 g, 4°C’de 15 dk santrifüj edildi.
Üst sıvı faz yeni bir tüpe aktarıldı ve üzerine 0.5 ml izopropanol eklendi.
4°C’de 10 dk inkübe edildi.
12,000 × g, 4°C’de 10 dk santrifüj edildi.
Süpernatant uzaklaştırıldı, pellet 1 ml %75 ethanol ile yıkandı, vortexlendi.
7500 × g, 4°C’de 5 dk santrifüj edildi.
Süpernatant uzaklaştırıldı ve RNA kuruması için 5‑10 dk buz üzerinde bırakıldı.
RNA pelleti 25 µL nuclease free su ile çözdürüldü.
Qubit 4 Flourometer kullanılarak RNA konsantrasyonu ölçüldü.

cDNA Synthesis

FirstStrand cDNA Synthesis Kit (PROCOMCURE Biotech GmbH, PCCSKU1301) kullanılarak 0.2 ug RNA’dan cDNA sentezlendi.

5X VS Reaction Buffer VitaScript™	4 µl
Enzyme Mix	1 µl
Total RNA	1‑6 µl
Nuclease‑free dH2O	Up to 20 µl

Tablo1

Reaksiyon bileşenlerinin buz üzerinde çözünmesi beklendi.
Ardından tablo1’de belirtilen miktarlarda bileşenler bir araya getirilerek reaksiyon kuruldu.
42°C’de 60 dk

80°C’de 10 dk

Real time PCR

2X Magic SYBR Mix (PROCOMCURE Biotech GmbH, PCCSKU1107) kullanılarak Real Time PCR yapıldı.

2X Magic SYBR Mix	10 µl
Template DNA	2 µl
Forward primer (10 µM)	0.4 µl
Reverse primer (10 µM)	0.4 µl
Nuclease free water	Up to 20 µl

Tablo2

Reaksiyon bileşenlerinin buz üzerinde çözünmesi beklendi.
Ardından tablo1’de belirtilen miktarlarda bileşenler bir araya getirilerek reaksiyon kuruldu.
95°C 5 dk 1 Cycle

95°C 10 saniye 40 Cycle

60°C 15 saniye 40 Cycle

72°C 20 saniye 40 Cycle

72°C 2 dk 1 Cycle

Detay

WESTERN BLOT PROTOKOL

WESTERN BLOT PROTOKOL

Doku Homojenizasyonu: Doku numuneleri 100 mg olacak şekilde kesilir ve 1 ml RIPA Buffer+Protease inhibitör kokteyl karışımı ile homojenizasyon cihazında 3200 RPM de 2 tekrarlı olacak şekilde homojenize edilir. 12.000 RPM’de 10 dk +4’de santrifüj edilir. Süpernatant temiz eppendorf tüplere aktarılır ve protein konsantrasyonları ölçülür.
Protein Konsantrasyon Ölçümü: Qubit 4 fluorometer cihazı kullanılarak Qubit Protein BR kiti ile kit talimatları takip edilerek örneklerin protein konsantrasyonları ölçülür.

SDS‑PAGE

Örnek Yükleme: Konsantrasyonları hesaplanan protein örnekleri, son konsantrasyonları 20 µg/µl olacak şekilde, 2X Laemli buffer, %10 Beta Merkaptoethanol ile karıştırılır. (Örnek, Laemli oranı 1:1). Isı bloğunda 95 °C’de 5 dk inkübe edilir, ardından örnekler spin down edilir.Jelde 1. Kuyuya 5 ul protein marker yüklenir, diğer kuyulara konsantrasyonu 20 µg/µl olacak şekilde sırasıyla protein örnekleri yüklenir ve transfer sistemi çalıştırılır.
Transfer: Membran %100 methanol içerisinde yaklaşık 3‑4 dk inkübe edilir, sonrasında 1X transfer buffer ile dengelenir. Blotlama cihazının aparatına 2 adet filtre kağıdı yerleştirilir üzerine 1X transfer buffer ile dengelenmiş membran, pens yardımı ile yerleştirilir. Membran üzerine jel dikkatlice yerleştirilir. Jel üzerine 2 adet filtre kağıdı yerleştirilir, merdane ile üzerinde geçilerek hava kabarcığı kalmamasına dikkat edilir.
Bloklama: Transfer işlemi ardından membran %3 BSA ile, oda ısısında 1 saat, orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edilir.
Primer Antikor: Membran üzerine 1:1000 oranında hazırlanmış olan %5 BSA+primer SIRT‑1 antikor karışımı koyulur. Karanlıkta, +4 °C’de gece boyu, orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edilir.
Yıkama ve Seconder Antikor: Gece boyu inkübasyon ardından membranlar 1X TBS‑T ile 5 dk 5 tekrar olacak şekilde yıkanır. Membran üzerine 1:20000 oranında hazırlanmış olan seconder antikor karışımı koyulur. Oda ısısında karanlıkta 1 saat inkübe edilir. İnkübasyon süresi sonunda membranlar 1X TBS‑T ile 5 dk 5 tekrar olacak şekilde yıkanır.
Görüntüleme: West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate kullanılarak, iBright 750 (ThermoFisher Scientific) cihazında membranların görüntüsü alınır.

WESTERN BLOT PROTOCOL

Tissue Homogenization: Tissue samples are cut to 100 mg and homogenized in 1 ml RIPA Buffer + Protease Inhibitor Cocktail using a homogenizer at 3200 RPM for 2 cycles. The homogenate is centrifuged at 12,000 RPM for 10 minutes at +4°C. The supernatant is transferred to clean Eppendorf tubes, and protein concentrations are measured.
Protein Concentration Measurement: Protein concentrations of the samples are measured using the Qubit 4 Fluorometer with the Qubit Protein BR Kit, following the kit instructions.

SDS‑PAGE

Sample Loading: Protein samples, whose concentrations have been determined, are prepared to a final concentration of 20 µg/µl by mixing with 2X Laemmli buffer and 10% Beta‑Mercaptoethanol (sample: Laemmli ratio = 1:1). The samples are incubated at 95°C for 5 minutes in a heat block, followed by a quick spin down. A 5 µl protein marker is loaded into the first well of the gel, and the protein samples (adjusted to 20 µg/µl) are loaded into the remaining wells. The electrophoresis system is then run.
Transfer: The membrane is incubated in 100% methanol for approximately 3–4 minutes, then equilibrated in 1X transfer buffer. In the blotting apparatus: Two filter papers are placed at the bottom. The equilibrated membrane is placed on top using tweezers. The gel is carefully placed on the membrane. Two more filter papers are placed on top. A roller is used to remove air bubbles.
Blocking: After transfer, the membrane is incubated in 3% BSA at room temperature for 1 hour on an orbital shaker.
Primary Antibody Incubation: The membrane is incubated with a 1:1000 dilution of the primary SIRT‑1 antibody in 5% BSA at +4°C overnight on an orbital shaker, in the dark.
Washing & Secondary Antibody Incubation: After overnight incubation, membranes are washed 5 times for 5 minutes each with 1X TBS‑T. The membrane is then incubated with a 1:20000 dilution of the secondary antibody at room temperature for 1 hour in the dark. After incubation, the membrane is washed 5 times for 5 minutes each with 1X TBS‑T.
Imaging: The membrane is visualized using West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate on an iBright 750 (ThermoFisher Scientific) imaging system.

Detay

Histopatoloji ve Immunohistokimya Metodu

Deney Prosedürünün Sonlandırılması ve Örneklerinin Alınması

……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… (Noktalı alana çalışma hakkında bilgiler yazılmalıdır) histopatolojik analizlerin yapılması için %10 nötral formaldehite alınacak ve ilgili laboratuvara gönderilecektir.

Histopatolojik değerlendirme

Tüm ……….(insan,rat, Mouse vb noktalı alana yazılmalıdır) alınan ………(Deri,kalp,karaciğer vb noktalı alana yazılmalıdır) örnekleri %10 tamponlu formaldehit ile fikse edildikten sonra, etanol içinde dehidrate edilip, ksilen içinde şeffaflandırılacak ve parafine gömülecektir. Kızaklı mikrotom (Leica Microsystems, Almanya) kullanılarak 5‑6 µm kalınlığında kesitler alınacaktır. Alınan kesitlerde deparafinizasyon sonrasında hizmet alımı yapılan firma tarafından epidermis ve dermis bölgelerinin morfolojik özelliklerini değerlendirmek, fibroblast görüntüleme ve epidermis kalınlığını ölçebilmek için hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması yapılacaktır. Rutin bir yöntem olan hematoksilen‑eozin boyaması, mavi‑mor renk veren hematoksilen ile çekirdeklerin, pembemsi kırmızı renk veren eozinin ile sitoplazmaların boyanması işlemidir. Histopatolojik belirtiler, kör iki patolog tarafından 200 ve 400x büyütmede optik mikroskop altında rastgele en az 5 alandan kamera ataçmanlı mikroskop (Leica Microsystems, Almanya) kullanılarak değerlendirilerek fotoğraflanacaktır.

İmmünohistokimyasal değerlendirme

Mikroskop incelemesinde Rozasea patofizyolojisinde rol oynayan ……………………. (çalışmada bakılacak antikor isim ve/veya isimleri noktalı alana yazılmalıdır) ekspresyonu kontrol grubuna karşı incelenecektir. ……….(insan,rat, Mouse vb noktalı alana yazılmalıdır) ait ………(Deri,kalp,karaciğer vb noktalı alana yazılmalıdır) örneklerinin parafin bloklarından elde edilen 5‑6 µm kalınlığında kesitler poli‑L‑lizin kaplı lamlara alındıktan sonra deparafinizasyon gerçekleştirilecektir. Rehidratasyon sonrası pH’sı 6 olan sitrat tampon çözeltisi ile antijen geri çağırma işlemi yapılacaktır. 5 dk süreyle % 3 H2O2 solüsyonuyla endojen peroksidaz blokajı sonrası spesifik olmayan boyanmaları önlemek için serum blokaj işlemi yapılacaktır. Bu işlemler sonrası ……………………. (çalışmada bakılacak antikor isim ve/veya isimleri noktalı alana yazılmalıdır) primer antikorları ile kesitler nemli küvet içinde bir gece (over night) + 4⁰C’da inkübe edilecektir. Primer antikorlar sonrası PBS ile yıkanan kesitler sekonder antikor ile (Goat anti rabbit) oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilecektir. Kromojen olarak, diaminobenzidin (DAB) solüsyonu kullanılacaktır. Sonrasında çekirdek işaretlemesi için Mayer’s hematoksilen boyası uygulanıp, dehitratasyon sonrası kesitler entellanla kapatılacaktır. Elde edilen işaretli dokulardan kamera ataçmanlı mikroskop (Leica Microsystems, Almanya) ile 400x lik büyütmede en az 5 mikrograf alınacaktır. Elde edilen mikrograflarda boyanmalar H‑score yöntemi kullanılarak işaretlenmeler 2 kör patolog tarafından skorlanacaktır.

Detay

Hizmet kataloğumuz

Hizmet kataloğumuzu indirebilirsiniz:

İçerik: