Western Blot Numune Alım Prosedürü

Hücre Kültürü Numuneleri İçin:

Adherent Hücreler İçin (Petri Kabı)

* Hücreler %80 yoğunluğa ulaşınca toplanmalıdır.

** Çalışma buz üzerinde gerçekleştirilmelidir.

*** Çalışmaya başlamadan önce santrifüj 4 °C’ye soğutulmalıdır.

1. Hücrelerin ekili olduğu petri kabı buz üzerine yerleştirilir.
2. Hücrelerin üzerindeki besiyeri dikkatlice aspire edilir.
3. Hücreler, besiyeri kalıntılarını uzaklaştırmak için soğuk 10 ml PBS kullanarak yıkanır ve ardından PBS aspire edilir.

*PBS eklenirken dikkatli olunmalıdır. PBS yavaşça, hücreleri kaldırmamaya dikkat ederek eklenmeli ve dikkatlice karıştırılmalıdır. (Besiyeri hacmine eşit hacimde soğuk PBS kullanılabilir)

1. Yıkama işlemi 2 kere tekrar edilir.
2. Yıkama işlemi sonrası hücrelerin üzerine soğuk lizis tamponu eklenir ve buz üzerinde 5 ‑ 10 dk inkübe edilir.

*Lizis tamponu miktarı ve inkübasyon süresi kullanılan tampona veya kite bağlı olarak değişmektedir.

**Lizis tamponu içerisine kullanmandan hemen önce Protease inhibitörü eklenmelidir, bu sayede protein bozunması engellenmektedir.

1. İnkübasyon ardından soğuk hücre kazıyıcı kullanarak hücreler kazınır ve hücreler toplanarak mikrosantrifüj tüpü içerisine koyulur.
2. Tüpler 14.000 G, 4 °C’de 15 dk santrifüj edilir.

*Kullanılan tampona veya kite göre santrifüj değerleri değişim gösterebilmektedir.

1. Santrifüj sonrası süpernatant yeni ve temiz bir tüpe aktarılır ve buza gömülür.

* Süpernatantı alırken 200 µl’lik pipet ucu kullanılması tavsiye edilir.

9‑ Örnekler daha sonra kullanmak için ‑80°C'de saklanmalıdır.

*Örneklerin alikotlayarak saklanması tavsiye edilir.

Adherent Hücreler İçin (Flask)

1. Hücrelerin üzerinde bulunan besiyeri aspire edilir.
2. Hücrelerin üzerine 10ml PBS eklenerek hücreler yıkanır, yıkama işlemi ardından PBS aspire edilir.
3. Yıkanan hücrelerin üzerine Tripsin solüsyonundan 3mL eklenir ve inkübatörde birkaç dakika (3‑5 dk) bekletilir (tripsin aktivitesinin artması için flaskın inkübatöre yerleştirilmesi tavsiye edilir).
4. İnkübasyon işlemi sonrası tripsin inhibisyonu için hücrelerin üzerine 6mL fullbesiyeri (%10 FBS, %1 Penisilin streptomisin,%1 L‑Glutamin içeren highglucose DMEM) eklenir ve hücreler aşağıda toplanacak şekilde pipetaj yapılır.

* Hücreler ortamdan kolay kalkmadığı durumlarda elle flaska vurularak kaldırılabilir.

1. Sonra bu karışım falkona aktarılıp 1800 rpm 4 °C’de 5dk santrifüj edilir.
2. Santrifüj sonunda alttaki pellet bozulmayacak şekilde süpernatantın hepsi atılır.
3. Hücre pelletini uygun bir lysis buffer (örneğin, RIPA buffer, NP‑40) ile karıştırılır ve buz üzerinde 5‑10 dk inkübe edilir. (İnkübasyon süresi kullanılan buffer ve kite bağlı olarak değişebilmektedir)

*Lizis tamponu içerisine kullanmandan hemen önce Protease inhibitörü eklenmelidir, bu sayede protein bozunması engellenmektedir.

1. İnkübasyon sonrası, karışımı 12,000G’de 10‑15 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı alın (Süpernatant, toplam proteinleri içerir).
2. Santrifüj sonrası süpernatant yeni ve temiz bir tüpe aktarılır ve buza gömülür.
3. Örnekler daha sonra kullanmak için ‑80°C'de saklanmalıdır.
4. Örneklerin alikotlayarak saklanması tavsiye edilir.

Numunelerin Transferi:

Numuneleriniz uygun koşullarda şirketimiz tarafından transfer edilecektir. Şirketimiz numunelerin transferini 78.5°C sağlayan kurubuz ile yapmaktadır.

Süspanse Hücreler İçin:

* Hücreler %80 yoğunluğa ulaşınca toplanmalıdır.

** Çalışma buz üzerinde gerçekleştirilmelidir.

*** Çalışmaya başlamadan önce santrifüj 4 °C’ye soğutulmalıdır.

1. Hücrelerin ekili olduğu flask / petri kabı buz üzerine yerleştirilir.
2. Flask / petri kabı içerisinde ekili olan hücre süspansiyonu bol pipetaj yapılarak toplanır ve falkon tüpe aktarılır.

*Bu aşamada flask yüzeyinde bulunan tüm hücreler toplanmaya çalışılmalıdır.

1. Falkon santrifüje yerleştirilir ve 4 °C 2500G’de 5‑10 dk santrifüj edilir.
2. Santrifüj işlemi sonrası hücreler tüpün dibinde toplanacaktır (pellet) üstteki sıvı pellete dokunmamaya çalışarak dikkatlice atılır.

*Hücre pasajlama protokolünde uygulanılan süre ve RPM’de santrifüj işlemini gerçekleştirilebilir.

1. Test tüpü buz üzerine yerleştirilir, pellet soğuk PBS ile yeniden süspanse edilerek bir kez yıkanır.
2. Süspanse hücreler 4 °C 2.500G’de 5‑10 dk santrifuj edilir ve üstte bulunan sıvıyı atılır.
3. Test tüpü buz üzerine yerleştirilir, pellet üzerine lizis tamponu eklenir ve yukarı aşağı pipetaj yaparak hücreleri tekrar süspanse hale getirilir.
4. Hücre süspansiyonunu buz üzerinde 5‑10 dk bekletilir, hücrelerin parçalanması için ara ara çalkalanır.

*İnkübasyon süresi kullanılan lizis tamponuna bağlı olarak değişebilmektedir.

1. İnkübasyon süresi ardından hücre süspansiyonunu 4°C'de 14.000 G'de 15 dk santrifüjleyin.
2. Üstteki sıvıyı yeni ve temiz bir tüpe aktarın ve buza gömün.
3. Örnekler daha sonra kullanmak için ‑80°C'de saklanmalıdır.

*Örneklerin alikotlayarak saklanması tavsiye edilir.

Numunelerin Transferi:

Numuneleriniz uygun koşullarda şirketimiz tarafından transfer edilecektir. Şirketimiz numunelerin transferini 78.5°C sağlayan kurubuz ile yapmaktadır.

Doku Numuneleri İçin:

Çalışmaları buz üzerinde gerçekleştirin, mümkün olduğu kadar çabuk bir şekilde dokudan parçalara ayırın.

1. İlgi duyduğunuz dokuyu temiz aletler ile ayırın. (Bu aşama buz üzerinde gerçekleştirilmeli ve proteaz bozulmasını önlemek için mümkün olduğunca çabuk yapılmalı.)
2. Ardından dokuyu soğuk 1X PBS ile kısa bir süre yıkayın. (Bu aşama dokuda bulunan kanı uzaklaştırmak için gerekmektedir ancak oldukça dikkatli olunmalı)

*Karaciğer, dalak gibi kan miktarı yüksek dokularda nazikçe yıkama yapılarak doku kandan temizlenmelidir.

*Beyin ve Testis dokusu gibi az kan bulunan dokularda yıkama işlemi yapılmaması tavsiye edilir.

1. Doku alındıktan hemen sonra, dokuyu buz üzerinde tutarken daha küçük parçalara kesin, Eppendorf tüplerine koyun ve sıvı nitrojene daldırıp anında dondurun.

*Eppendorf tüpler etiketlenmelidir.

**Çalışma için 0.1 g doku yeterli olmaktadır.

1. Örnekler daha sonra kullanmak için ‑80°C'de saklanmalıdır.

Numunelerin Transferi:

Numuneleriniz uygun koşullarda şirketimiz tarafından transfer edilecektir. Şirketimiz numunelerin transferini 78.5°C sağlayan kurubuz ile yapmaktadır.