Histopatoloji ve Immunohistokimya Metodu

Deney Prosedürünün Sonlandırılması ve Örneklerinin Alınması

……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… (Noktalı alana çalışma hakkında bilgiler yazılmalıdır) histopatolojik analizlerin yapılması için %10 nötral formaldehite alınacak ve ilgili laboratuvara gönderilecektir.

Histopatolojik değerlendirme

Tüm ……….(insan,rat, Mouse vb noktalı alana yazılmalıdır) alınan ………(Deri,kalp,karaciğer vb noktalı alana yazılmalıdır) örnekleri %10 tamponlu formaldehit ile fikse edildikten sonra, etanol içinde dehidrate edilip, ksilen içinde şeffaflandırılacak ve parafine gömülecektir. Kızaklı mikrotom (Leica Microsystems, Almanya) kullanılarak 5‑6 µm kalınlığında kesitler alınacaktır. Alınan kesitlerde deparafinizasyon sonrasında hizmet alımı yapılan firma tarafından epidermis ve dermis bölgelerinin morfolojik özelliklerini değerlendirmek, fibroblast görüntüleme ve epidermis kalınlığını ölçebilmek için hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması yapılacaktır. Rutin bir yöntem olan hematoksilen‑eozin boyaması, mavi‑mor renk veren hematoksilen ile çekirdeklerin, pembemsi kırmızı renk veren eozinin ile sitoplazmaların boyanması işlemidir. Histopatolojik belirtiler, kör iki patolog tarafından 200 ve 400x büyütmede optik mikroskop altında rastgele en az 5 alandan kamera ataçmanlı mikroskop (Leica Microsystems, Almanya) kullanılarak değerlendirilerek fotoğraflanacaktır.

İmmünohistokimyasal değerlendirme

Mikroskop incelemesinde Rozasea patofizyolojisinde rol oynayan ……………………. (çalışmada bakılacak antikor isim ve/veya isimleri noktalı alana yazılmalıdır) ekspresyonu kontrol grubuna karşı incelenecektir. ……….(insan,rat, Mouse vb noktalı alana yazılmalıdır) ait ………(Deri,kalp,karaciğer vb noktalı alana yazılmalıdır) örneklerinin parafin bloklarından elde edilen 5‑6 µm kalınlığında kesitler poli‑L‑lizin kaplı lamlara alındıktan sonra deparafinizasyon gerçekleştirilecektir. Rehidratasyon sonrası pH’sı 6 olan sitrat tampon çözeltisi ile antijen geri çağırma işlemi yapılacaktır. 5 dk süreyle % 3 H2O2 solüsyonuyla endojen peroksidaz blokajı sonrası spesifik olmayan boyanmaları önlemek için serum blokaj işlemi yapılacaktır. Bu işlemler sonrası ……………………. (çalışmada bakılacak antikor isim ve/veya isimleri noktalı alana yazılmalıdır) primer antikorları ile kesitler nemli küvet içinde bir gece (over night) + 4⁰C’da inkübe edilecektir. Primer antikorlar sonrası PBS ile yıkanan kesitler sekonder antikor ile (Goat anti rabbit) oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilecektir. Kromojen olarak, diaminobenzidin (DAB) solüsyonu kullanılacaktır. Sonrasında çekirdek işaretlemesi için Mayer’s hematoksilen boyası uygulanıp, dehitratasyon sonrası kesitler entellanla kapatılacaktır. Elde edilen işaretli dokulardan kamera ataçmanlı mikroskop (Leica Microsystems, Almanya) ile 400x lik büyütmede en az 5 mikrograf alınacaktır. Elde edilen mikrograflarda boyanmalar H‑score yöntemi kullanılarak işaretlenmeler 2 kör patolog tarafından skorlanacaktır.