TAS-TOS (Relassay) ÇALIŞMASI İÇİN HÜCRE KÜLTÜRÜ NUMUNE HAZIRLAMA YÖNTEMİ

TAS‑TOS (Relassay) ÇALIŞMASI İÇİN HÜCRE KÜLTÜRÜ NUMUNE HAZIRLAMA YÖNTEMİ

(1. Yöntem)

6’lık well plate içinde 1x106 hücre/well olacak şekilde ekilen ve daha sonra uygulama yapılan hücreler, uygulama sonrasında 1 ml soğuk PBS ve scraper yardımı ile kazınır. Daha sonra kalan hücreleri toplamak için 1 ml daha soğuk PBS ile hücreler kuyulardan 2 ml’lik ependorflara (tüplere) alınır. Tüpler buz üzerinde tutulmalıdır. Daha sonra tüpler 10.000 RPM’de +40 C’de 5 dakika santrifüj edilir. Tüplerdeki PBS çekilir ve atılır. Pelletin üzerine soğuk çözme tamponu eklenir. Tüpler buzda bekletilir. Pipetaj yapılır. Tüpler 10‑15 dakika buzda bekletilir. (Bu süre 30 dk ya kadar çıkarılabilir). Tüpler, her 5 dk’da bir vortekslenir. Daha sonra 10.000 G’de 30 dakika +4 C’de santrifüj edilir. Süpernatant temiz bir tüpe alınır ve pellet atılır. Süpernatant kısmından TAS‑TOS seviyesine bakılır.

Çözme tamponu hazırlanışı (10 ml) pH=7,8

1M Tris Buffer (10 mL) pH:7,2

‑1,21 g Tris

‑3 mL ddH2O ile çözülür. HCl ile pH ayarlaması yapılır. 10 mL’ye ddH2O ile tamamlanır.

2M NaCl (50 mL)

‑5,85 g NaCl tartılır

‑50 mL ddH2O ile çözülür.

1M MgCl2 (10 mL)

‑2,03 g MgCl2 tartılır.

‑10 mL ddH2O ile çözülür.

TAS‑TOS için çözme tamponu (10 mL)

‑1M Tris Buffer (10 mL) pH:7,2’den 100 µl,

‑2M NaCl’den 5 mL

‑1M MgCl2 (10 mL)’den 500 µl,

‑Triton X‑100’den 100 µl alınır.

‑10 mL’ye ddH2O ile tamamlanır.

‑pH 7,8’ ayarlanır.

(2. Yöntem)

HÜCRE KÜLTÜRÜNDE TAS, TOS

*Hücre kültürü çalışmalarında hücre kültür mediumu solusyonu ayrı ve hücre lizatları ayrı çalışılır.

Hücre Kültür Mediumu Çalışması

Hücrelerin üzerindeki medium (hücrelerin üzerinden toplanan sıvı besiyeri ) falkona aktarılarak ya hemen ya da ‑20/‑80°C’de saklanıp direk olarak (serum gibi) çalışılır.

Hücre Lizatları Çalışması

Hücreler tripsin‑EDTA ile kaldırılmadan önce pH7.4, 100mM PBS ile 1 defa yıkanır (yıkama hacmi 5mL) ve üstteki sıvı atılır.

Flaska tutunan hücreleri kaldırmak için flask içerisine %0.05 Tripsin içeren Tripsin‑EDTA solüsyonundan 2mL eklenir (tripsin aktivitesinin artması için flask inkübatöreyerleştirilebilir).

Birkaç dakika (1‑5 dk) sonra hücreler flasktan ayrılır. Hücreler ortamdan kolay kalkmadığı durumlarda elle flaska vurularak kaldırılabilir.

Tripsinin inhibisyonu için 6mL fullbesiyeri (%10 FBS, %1 Penisilin streptomisin,%1 L‑Glutamin içeren highglucose DMEM) flask içerisine eklenir. Sonra bu karışım falkona aktarılıp 1800 rpm 5dk santrifüj edilir.

Santrifüj sonunda alttaki pellet bozulmayacak şekilde süpernatantın hepsi atılır. (Pellette yaklaşık 1*106 hücre vardır ve bir kırmızı mercimek büyüklüğündedir, bu değer 75 ml lik flask değeridir).

Hücrelere sayma işlemiyapılır.

Pelletten hücre lizatının (hücreler parçalandıktan sonra santrifüj sonrası elde edilen süpernatant) elde edilmesi:

Pellet üzerine 500 mikrolitre, 140 mM KCl çözeltisi eklenip hücreler homojenize edilir.

Daha sonra hücreler sonikatörde birkaç dakika parçalanır.

15 dk 14000 rpm’de santrifüj edilir ve süpernatant ya hemen çalışılır/ ya da çalışılmak için ‑20/‑80°C derin dondurucuya kaldırılır.

Hücrelerin üzerinden toplanan Mediumda; TAS, TOS sonuçları tıpkı serum örneğindeki gibi medium hacmi başına verilir.

Hücre lizatının süpernatantında; TAS,TOS ve mikroprotein düzeyi ölçülür. Sonuçlar hücre lizatının mg protein başına ya da hücre başına (örneğin 0,5 ml de bir milyon hücre varsa bir litrede 2 milyar hücre vardır) verilir.

*Hücre Kültür Mediumu Çalışmasında fenol red’den gelen rengi ekarte etmek için ikinci dalga boyu olarak 570 nm seçilir.

**Hücre lizatları için bu nm de ikincil dalga boyu seçilmesine gerek yoktur.