WESTERN BLOT PROTOKOL

WESTERN BLOT PROTOKOL

1. Doku Homojenizasyonu: Doku numuneleri 100 mg olacak şekilde kesilir ve 1 ml RIPA Buffer+Protease inhibitör kokteyl karışımı ile homojenizasyon cihazında 3200 RPM de 2 tekrarlı olacak şekilde homojenize edilir. 12.000 RPM’de 10 dk +4’de santrifüj edilir. Süpernatant temiz eppendorf tüplere aktarılır ve protein konsantrasyonları ölçülür.
2. Protein Konsantrasyon Ölçümü: Qubit 4 fluorometer cihazı kullanılarak Qubit Protein BR kiti ile kit talimatları takip edilerek örneklerin protein konsantrasyonları ölçülür.

SDS‑PAGE

1. Örnek Yükleme: Konsantrasyonları hesaplanan protein örnekleri, son konsantrasyonları 20 µg/µl olacak şekilde, 2X Laemli buffer, %10 Beta Merkaptoethanol ile karıştırılır. (Örnek, Laemli oranı 1:1). Isı bloğunda 95 °C’de 5 dk inkübe edilir, ardından örnekler spin down edilir.Jelde 1. Kuyuya 5 ul protein marker yüklenir, diğer kuyulara konsantrasyonu 20 µg/µl olacak şekilde sırasıyla protein örnekleri yüklenir ve transfer sistemi çalıştırılır.
2. Transfer: Membran %100 methanol içerisinde yaklaşık 3‑4 dk inkübe edilir, sonrasında 1X transfer buffer ile dengelenir. Blotlama cihazının aparatına 2 adet filtre kağıdı yerleştirilir üzerine 1X transfer buffer ile dengelenmiş membran, pens yardımı ile yerleştirilir. Membran üzerine jel dikkatlice yerleştirilir. Jel üzerine 2 adet filtre kağıdı yerleştirilir, merdane ile üzerinde geçilerek hava kabarcığı kalmamasına dikkat edilir.
3. Bloklama: Transfer işlemi ardından membran %3 BSA ile, oda ısısında 1 saat, orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edilir.
4. Primer Antikor: Membran üzerine 1:1000 oranında hazırlanmış olan %5 BSA+primer SIRT‑1 antikor karışımı koyulur. Karanlıkta, +4 °C’de gece boyu, orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edilir.
5. Yıkama ve Seconder Antikor: Gece boyu inkübasyon ardından membranlar 1X TBS‑T ile 5 dk 5 tekrar olacak şekilde yıkanır. Membran üzerine 1:20000 oranında hazırlanmış olan seconder antikor karışımı koyulur. Oda ısısında karanlıkta 1 saat inkübe edilir. İnkübasyon süresi sonunda membranlar 1X TBS‑T ile 5 dk 5 tekrar olacak şekilde yıkanır.
6. Görüntüleme: West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate kullanılarak, iBright 750 (ThermoFisher Scientific) cihazında membranların görüntüsü alınır.

WESTERN BLOT PROTOCOL

1. Tissue Homogenization: Tissue samples are cut to 100 mg and homogenized in 1 ml RIPA Buffer + Protease Inhibitor Cocktail using a homogenizer at 3200 RPM for 2 cycles. The homogenate is centrifuged at 12,000 RPM for 10 minutes at +4°C. The supernatant is transferred to clean Eppendorf tubes, and protein concentrations are measured.
2. Protein Concentration Measurement: Protein concentrations of the samples are measured using the Qubit 4 Fluorometer with the Qubit Protein BR Kit, following the kit instructions.

SDS‑PAGE

1. Sample Loading: Protein samples, whose concentrations have been determined, are prepared to a final concentration of 20 µg/µl by mixing with 2X Laemmli buffer and 10% Beta‑Mercaptoethanol (sample: Laemmli ratio = 1:1). The samples are incubated at 95°C for 5 minutes in a heat block, followed by a quick spin down. A 5 µl protein marker is loaded into the first well of the gel, and the protein samples (adjusted to 20 µg/µl) are loaded into the remaining wells. The electrophoresis system is then run.
2. Transfer: The membrane is incubated in 100% methanol for approximately 3–4 minutes, then equilibrated in 1X transfer buffer. In the blotting apparatus: Two filter papers are placed at the bottom. The equilibrated membrane is placed on top using tweezers. The gel is carefully placed on the membrane. Two more filter papers are placed on top. A roller is used to remove air bubbles.
3. Blocking: After transfer, the membrane is incubated in 3% BSA at room temperature for 1 hour on an orbital shaker.
4. Primary Antibody Incubation: The membrane is incubated with a 1:1000 dilution of the primary SIRT‑1 antibody in 5% BSA at +4°C overnight on an orbital shaker, in the dark.
5. Washing & Secondary Antibody Incubation: After overnight incubation, membranes are washed 5 times for 5 minutes each with 1X TBS‑T. The membrane is then incubated with a 1:20000 dilution of the secondary antibody at room temperature for 1 hour in the dark. After incubation, the membrane is washed 5 times for 5 minutes each with 1X TBS‑T.
6. Imaging: The membrane is visualized using West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate on an iBright 750 (ThermoFisher Scientific) imaging system.